本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术应用Crispr/cas9‑sgRNA慢病毒载体系统，在细胞水平上成功对人肝癌细胞IGF‑IR基因进行敲除或修饰，使肝癌细胞IGF‑IR基因转录水平明显下降，使肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降，为肝癌治疗提供有效新方法，具有临床应用前景。
A sgRNA targeting IGF IR gene and its application
The present invention relates to the technical field of gene engineering, and discloses a targeting IGF IR gene sgRNA nucleotide sequence of the sgRNA is shown as SEQ ID NO:2. The application of Crispr/cas9 sgRNA lentiviral vector system at the cellular level of deletion or modification of human hepatocellular carcinoma cell line IGF IR gene, the IGF cells transcription level of IR gene decreased significantly, the liver cancer cell proliferation, invasion and migration ability, provide a new effective method for the treatment of liver cancer, clinical application prospect.
【技术实现步骤摘要】
一种靶向IGF-IR基因的sgRNA及其应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种靶向IGF-IR基因的sgRNA及其应用。
技术介绍
新近研究发现IGF信号通路中关键信号分子IGF-IR，具有癌胚性，与肝癌进展间存在密切关系，但其基因转录或活化干预是否影响生物学功能与治疗价值尚不清楚。IGF家族(IGFs)由IGF-I、IGF-II、IGF-IR、IGF-IIR以及6种结合蛋白组成。IGFs与胰岛素有相似的分子结构，它的功能包括促进细胞增殖、分化和各种类型细胞的生存以及保持细胞的各种功能，其在体内生长调控中发挥重要作用。IGF-II的主要功能是产生生长因子，它在许多生长发育过程中起关键作用，并且在生长发育过程中以及成年后都广泛表达。愈来愈多的证据表明IGF-I和II及其酪氨酸激酶受体，参与HCC发生与发展。联合靶向IGF-IR和mTOR通路作为一种新型治疗方法，将最大限度的发挥抗肿瘤作用，且防止耐药机制早期发展。介于IGF-IR在肝癌形成、恶性转化及侵袭转移过程中都扮演着重要角色，阻断该信号通路，有望使癌细胞生长受抑、诱导癌细胞发生凋亡或增加对放、化疗敏感性，表明酪氨酸激酶受体IGF-IR已成为小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗体药物设计及核酸干预的重要靶点。新近一项CRISPR/Cas9基因敲除新技术，突破物种限制可敲除任何基因。CRISPRRNA是原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒的入侵，在II型CRISPR系统中，其形成的复合物首先特异识别基因组序列，然后Cas9核酸内切酶切断目的基因双链。Cas9以序列特异性方式绑定和切割DNA能力非常强大，近年被广泛应用于各种基因组的研究包括HBV基因。尚未见定向剪接肝癌IGF-IR基因的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异靶向IGF-IR基因的sgRNA导向序列。该sgRNA导向序列可以用于敲除肝癌细胞中IGF-IR基因，使其转录水平明显下降，使肝癌HepG2细胞的生物学特性发生明显改变，表现为癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种靶向IGF-IR基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，能识别人肝癌细胞染色体上IGF-IR基因，和与Cas9核酸酶结合的骨架RNA片段。本专利技术另一个目的在于提供由编码所述靶向IGF-IR基因的sgRNA的DNA分子。本专利技术第三个目的是提供上述sgRNA在特异识别和靶向修饰人肝癌细胞IGF-IR基因中的应用。所述人肝癌细胞IGF-IR基因，其基因组序列是NCBINM000875中的区域。本专利技术第四个目的是提供上述sgRNA在构建人肝癌细胞IGF-IR基因突变库中的应用。所述人肝癌细胞IGF-IR基因，其基因组序列是NCBINM000875中的区域。现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种特异靶向识别IGF-IR基因的sgRNA，并提供了该sgRNA的编码DNA片段，应用Crispr/cas9-sgRNA慢病毒载体系统，在细胞水平上成功对人肝癌细胞IGF-IR基因进行敲除或修饰，使肝癌细胞IGF-IR基因转录水平明显下降，使肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降，为肝癌治疗提供有效新方法，具有临床应用前景。附图说明图1为嘌呤霉素筛选经cas9病毒感染的细胞。图2为二次感染带荧光的sgRNA病毒，其中，A：普通光镜图；B：同一视野荧光显微镜图；A&B1-3为sgRNA(+)病毒感染组，A&B4为sgRNA(-)病毒感染组。图3为二次感染带荧光的sgRNA病毒感染效率直方图；sgRNA1-3为sgRNA(+)病毒感染组。图4为蛋白水平验证IGF-IR基因敲除效率Westernblotting图。图5为蛋白水平验证IGF-IR基因敲除效率QuantityOne(Bio-Rad)软件定量条带灰度强度，*：P<0.05。图6为敲除IGF-IR基因抑制肝癌细胞增殖活性影响的线性图，其中，*P<0.01，**P>0.05。图7为敲除IGF-IR基因抑制肝癌细胞增殖活性影响的直方图，其中，*P<0.01，**P>0.05。图8为肝癌HepG2细胞Transwell小室侵袭试验显微镜图，其中：A空白组；B阴性对照组；CsgRNA2感染组穿膜细胞数明显减少,*P<0.01。图9为肝癌HepG2细胞Transwell小室侵袭试验直方图，sgRNA2感染组穿膜细胞数明显减少,*P<0.01。图10为划痕试验法检测IGF-IR在肝癌细胞迁移中的作用显微镜图；其中，A1&A2:空白组，B1&B2:阴性对照，C1&C2:sgRNA2干预组。图11为肝癌HepG2细胞Transwell小室纵向迁移试验显微镜图，其中：A空白组；B阴性对照组；CsgRNA2感染组显示抑制纵向迁移能力,*P<0.01。图12为肝癌HepG2细胞Transwell小室纵向迁移试验直方图，sgRNA2感染组穿膜细胞数明显减少,*P<0.01。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。如无特殊说明，本专利技术以下实施例中选自以下材料，但并非是对本专利技术技术方案的限定。1)人肝癌细胞株人肝癌HepG2细胞株购自中科院上海细胞所，设三组：空白组(untreated组)、阴性组(LV-neg组)和感染组(LV-sgRNA-IGF-IR组,干扰-1，干扰-2和干扰-3)进行研究。2)细胞培养相关试剂DMEM培养基购自南京凯基生物科技有限公司；胎牛血清购自以色列BI公司；0.25％胰蛋白酶溶液购自美国Invitrogen公司；磷酸盐缓冲盐水(Phosphatebufferedsaline,PBS)购自coring有限公司；二甲基亚砜(DimethylsuLfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司。3)慢病毒感染相关试剂LV-sgRNA-IGF-IR(PCA00469，PCA00470，PCA00471)，阴性对照病毒Sg-RNA-CON244，LV-cas9-Puro(7768-1)，polybrene感染增强剂，Enis培养液等购自上海吉凯公司；嘌呤霉素购自北京索莱宝公司。4)蛋白分析相关试剂RIPA裂解液(强)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，BCA蛋白浓度测定试剂盒，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液等购自北京索莱宝公司；鼠抗人IGF-IR抗体、β-actin鼠抗人抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体均购自美国Abcam公司；预染蛋白Marker购自美国Thermo公司旗下Fermentas公司；PVDF膜，ImmobilonECL发光液购自美国Millipore公司。5)细胞增殖相关试剂CellCountingKit-8assay(CCK-8)试剂盒购自日本同仁化学研究所。6)其他试剂免疫组化试剂盒，一抗稀释液购自丹麦Dako公司。甘氨酸、Tris购自美国Bio-Rad公司；甲醇、三氯醋酸和醋酸等均为国产分析纯以上级产品。实施例1(1)HepG2细胞株复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种靶向IGF-IR基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA。3.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：董志珍，姚敏，王理，姚登福，郑文杰，蔡胤，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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