一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用技术

本发明专利技术公开了一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用。本发明专利技术提供了一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法：1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；2)将用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100‑300bp的片段化产物的切割产物；3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100‑300bp的片段化产物。本发明专利技术通过基于CRISPR基因编辑捕获靶序列，可用于高通量测序，适用于有家族遗传史的特定人群的筛查和大众体检市场等。

A method for capturing genomic target sequences based on Crispr/cas9 and its application in high throughput sequencing

The invention discloses a method for capturing genome target sequences based on Crispr/cas9 and its application in high throughput sequencing. The present invention provides a method for capturing target gene sequences from genomic DNA based on Crispr/cas9 system: 1), according to the target gene sequence design and synthesis of multiple gRNA; 2) will use the gRNA and the cas9 of the genome DNA of the enzyme cutting reaction, cut fragment products containing 100 300bp; 3) the fragment of the product of more than 100 300bp capture the cutting target gene sequences in the product. The invention can be used for high throughput sequencing by means of a target acquisition sequence based on CRISPR gene editing, and is suitable for screening specific populations of families with a genetic history and mass physical examination market.

【技术实现步骤摘要】
一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用。
技术介绍
CRlSPR/Cas(Clusteredregularlyinterspaccdshortpalindromicrepeats/CRlSPR-associatednuclease)技术是2013年开发的一种新的DNA靶向编辑工具，被美国科学杂志评为2013年十大科学突破技术之一。Cas9核酸酶，S.pyogenes，是RNA介导的核酸酶，可以催化双链DNA特异位点切割。切割位点位于NGGPAM(ProtospacerAdjacentMotif)上游序列的3个碱基处。PAM序列的NGG必须连在靶点之后，位于与gRNA互补的DNA的链上。其DNA特异识别是靠一小段发夹RNA结构实现的，而DNA剪切则是凭借结合于RNA上的Cas核酸酶执行。CRlSPR序列是存在于微生物基因组中，由长度25-50bp的重复序列(repeat，R)和间区序列(spacer，S)间隔成簇排列(R-S结构)而成的DNA序列，而Cas则是存在于CRISPR簇侧翼序列附近的多态性家族基因，编码可与CrisPR区域发生作用的一组功能域蛋白(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等的活性)。在指导RNA(guideRNA)的引导下对靶位点进行切割。此外，在CRISPR位点的第一个重复序列上游有CRISPR前导序列L(Leader)。该前导序列可以作为启动子，启动CRISPR序列的转录。前导序列、R-S结构以及一系列的Cas组成了完整的CRISPR/Cas系统。人们发现这些CRISPR序列能与病毒或质粒DNA序列相匹配，表明CRISPR/Cas系统能够编码“适应性”免疫系统，在细菌的获得性免疫中发挥作用。自人类基因组图谱绘制完成后，各国政府都加大了对人类基因组研究的扶持力度，在这样的大背景下，基因测序技术得到了迅猛发展，基因测序市场也快速扩大，并已经从实验室走入临床。基于液相捕获高通量测序技术，市场主要有安捷伦公司的全外显子捕获试剂盒，罗氏公司的固相杂交法和液相杂交法两种技术，这些产品捕获的DNA序列虽然只是全基因组的部分区域，相对于全基因组测序来说成本和时间花费上具有很大的优势，但每个样本的价格仍在数千元以上，超出了普通民众的承受范围，不适合大范围内筛查单基因遗传疾病的检测。而且这些技术的缺点是需要合成大量长片段(150－200bp)的DNA，经过PCR扩增，转录成加生物素修饰的RNA。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；每个所述gRNA能结合且识别所述目标基因序列不同靶区域；所述目标基因序列能通过所述gRNA引导cas9酶将其分隔为多个100-300bp的片段化产物；2)将用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100-300bp的片段化产物的切割产物；3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物。上述切割反应仅切割不修复。上述目标基因可以是一个目标基因或多个目标基因。上述方法中，步骤1)中，所述设计合成多个gRNA的方法为如下a或b：a所示的方法包括如下步骤：(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成用于制备其对应转录模板的引物对，得到多个所述gRNA转录模板对应的引物对；(2)将多个所述gRNA转录模板对应的引物对分别进行聚合酶链式反应，得到对应的多个所述gRNA转录模板，(3)转录所述对应的多个gRNA转录模板，得到多个gRNA；b所示的方法包括如下步骤：(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成对应的转录模板，得到多个gRNA转录模板；(2)转录所述多个gRNA转录模板，得到多个gRNA。上述方法中，所述转录多个gRNA转录模板为分别转录或者混合多个gRNA转录模板再共同转录；或所述捕获的方法为磁珠法。上述方法中，所述基因组DNA为人或动物或其他物种的细胞的基因组DNA；所述目标基因序列为BRCA1基因的外显子和BRCA2基因的外显子；所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列158-220；所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA的核苷酸序列分别为序列221-316；或所述BRCA1基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列1-序列63，下游引物的核苷酸序列为序列157；或所述BRCA2基因的外显子对应的多个gRNA对应的引物对中的上游引物的核苷酸序列分别为序列64-序列156，下游引物的核苷酸序列为序列157。上述的方法在目标基因序列的高通量测序文库制备中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的方法在目标基因序列的高通量测序中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术另一个目的是提供一种目标基因序列的高通量测序方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)上述的方法捕获所述目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物；2)用所述多个100-300bp的片段化产物制备高通量测序文库；3)高通量测序所述高通量测序文库，实现目标基因序列的高通量测序。Crispr/cas9系统在基因组DNA中捕获或分离或聚集目标基因序列中的应用也是本专利技术保护的范围；所述Crispr/cas9系统包括多个gRNA和cas9酶；所述多个gRNA引导所述CAS9酶将所述目标基因序列分割为多个大小为100-300bp片段化产物。本专利技术第3个目的是提供一种用于基因组DNA中捕获目标基因序列的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述应用中的所述Crispr/cas9系统。本专利技术第4个目的是提供一种高通量测序目标基因序列的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述应用中的所述Crispr/cas9系统和测序文库制备所需试剂。本专利技术通过基于CRISPR基因编辑捕获靶序列，可用于高通量测序，适用于有家族遗传史的特定人群的筛查和大众体检市场；更有意义的是，本项技术还可用于开发其他单基因、多基因遗传疾病的检测试剂盒及外显子测序捕获试剂,以供临床应用。附图说明图1为BRCA1gRNA和BRCA2gRNA质检结果。图2为文库扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳图。图3为文库胶回收产物2％琼脂糖凝胶电泳图。图4为文库检测PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、基于Crispr/cas9的捕获基因组中目标基因序列的方法下面的实施例以人293T细胞基因组DNA中的BRCA1和BRCA2基因为例，根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的外显子为目标基因序列。一、转录RNA模板制备1、转录RNA模板的引物设计合成根据目标基因组中BRCA1基因(GI:262359905)及BRCA2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法，包括如下步骤：1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；每个所述gRNA能结合且识别所述目标基因序列不同靶区域；所述目标基因序列能通过所述gRNA引导cas9酶将其切割为多个100‑300bp的片段化产物；2)用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100‑300bp的片段化产物的切割产物；3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100‑300bp的片段化产物。

【技术特征摘要】
1.一种基于Crispr/cas9系统从基因组DNA中捕获目标基因序列的方法，包括如下步骤：1)、根据目标基因序列设计合成多个gRNA；每个所述gRNA能结合且识别所述目标基因序列不同靶区域；所述目标基因序列能通过所述gRNA引导cas9酶将其切割为多个100-300bp的片段化产物；2)用所述多个gRNA和所述cas9酶对所述基因组DNA进行切割反应，得到含有多个100-300bp的片段化产物的切割产物；3)捕获所述切割产物中的目标基因序列的多个100-300bp的片段化产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述设计合成多个gRNA的方法为如下a或b：a所示的方法包括如下步骤：(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成用于制备其对应转录模板的引物对，得到多个所述gRNA转录模板对应的引物对；(2)将多个所述gRNA转录模板对应的引物对分别进行聚合酶链式反应，得到对应的多个所述gRNA转录模板，(3)转录所述对应的多个gRNA转录模板，得到多个gRNA；b所示的方法包括如下步骤：(1)根据所述目标基因序列设计多个所述gRNA，再根据所述gRNA设计合成对应的转录模板，得到多个gRNA转录模板；(2)转录所述多个gRNA转录模板，得到多个gRNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述转录多个gRNA转录模板为分别转录或者混合多个gRNA转录模板再共同转录；或所述捕获的方法为磁珠法。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述基因组DNA为人或动物或其他物种的细胞的基因组DNA；所述目标基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭良让，王德华，张佩琢，
申请(专利权)人：苏州吉赛基因测序科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32