一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针制造技术

为了克服传统检测技术的缺陷，本发明专利技术提供了一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针，包含4组下游引物、1组通用上游引物和1组共用阻断探针，具体为：针对ESR1基因Y537S突变的下游引物、针对ESR1基因Y537C突变的下游引物、针对ESR1基因Y537N突变的下游引物、针对ESR1基因Y538G突变的下游引物、针对ESR1基因的通用上游引物、针对ESR1基因的共用阻断探针。有益的技术效果：本发明专利技术具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及基于荧光PCR检测技术，具体涉及一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占中国女性恶性肿瘤之首。随着我国经济的发展和生活方式的改变，发病率也呈现快速上升的趋势。由于民众筛查意识的提高及诊疗水平的提高，乳腺癌患者的总体死亡率呈下降趋势。然而，对于耐药复发和有转移病灶的晚期乳腺癌患者预后仍然很差，也是目前女性肿瘤的主要死亡原因之一。人类雌激素受体α(EstrogenReceptorAlpha,ESRΑ)由ESR1(EstrogenReceptor1)基因编码。ESRα与其配体雌激素结合后，可激活细胞内一系列的细胞生物学效应。ESR1基因的突变和异常表达均与乳腺癌等疾病的发生有关。ESR1基因最为常见的突变类型为Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四种突变。这些突变将ESR1转换为了促癌基因，他们将ER锁定在一种永久激活的状态，因此无需激素就可以趋势肿瘤细胞生长。这就解释了这些肿瘤会对芳香酶抑制剂产生耐药的原因。目前已报道的应用于ESR1检测的方法主要为：直接测序法及二代测序技术。其中，直接测序技术成本低，准确性高，但是操作复杂，需要PCR后处理等步骤，易污染导致出现假阳性的结果,而且此方法的灵敏度不足，需要基因丰度达到10％时才能精确检出，故很难在临床中进行推广。二代测序技术灵敏度高，但是需要昂贵的仪器及分析设备，导致其检测成本大大提高，难以作为普适技术。综上所述，不论是：直接测序法还是二代测序技术在检测成本和检测精度上存在不足，需要进一步改进。
技术实现思路
为了克服传统检测技术的缺陷，本发提供了一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针，通过设计等位基因特异性引物，在一个反应中检测ESR1基因突变。本专利技术具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速等优点。本专利技术具体如下：一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针，包含下列4组下游引物、1组通用上游引物和1组共用阻断探针，具体为：(1)针对ESR1基因Y537S突变的下游引物：Y537S1、Y537S2和/或Y537S3，具体为：Y537S1：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAG-3’Y537S2：5’-TCTCCAGCAGCAGGTAAG-3’Y537S3：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTG-3’；(2)针对ESR1基因Y537C突变的下游引物：Y537C1、Y537C2、Y537C3和/或Y537C4，具体为：Y537C1：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTC-3’Y537C2：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAC-3’Y537C3：5’-CTCCAGCAGCAGGTGAC-3’Y537C4：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTTC-3’；(3)针对ESR1基因Y537N突变的下游引物：Y537N1、Y537N2、Y537N3和/或Y537N4，具体为：Y537N1：5’-TCCAGCAGCAGGTCAAT-3’Y537N2：5’-TCCAGCAGCAGGTCACT-3’Y537N3：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTTT-3’Y537N4：5’-CCAGCAGCAGGTCGTT-3’(4)针对ESR1基因Y538G突变的下游引物：Y538G1、Y538G2、Y538G3和/或Y538G4，具体为：Y538G1：5’-CATCTCCAGCAGCAGCC-3’Y538G2：5’-CATCTCCAGCAGCACGC-3’Y538G3：5’-CATCTCCAGCAGCACCC-3’Y538G4：5’-GCATCTCCAGCAGCAGCC-3’；(5)针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突变的通用上游引物Fp1、Fp2、Fp3、Fp4和/或Fp5，序列如下：Fp1：5’-TAGTCCTTTCTGTGTCTTCCCA-3’Fp2：5’-GGCTCGGGTTGGCTCTAA-3’Fp3：5’-AGTAACAAAGGCATGGAGCA-3’Fp4：5’-TTCCCCTTCTAGGGATTTCAGCACT-3’Fp5：5’-ACTCCTGGGGCTCGGGTTGGC-3’；(6)针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突变的共用阻断探针，该阻断探针的序列及修饰如下：阻断探针：5’-FAM-AAGTACGACATGTCTACGA-3’。进一步说，包括一对内控引物及一条内控引物探针；所述内控引物由TBPFp和TBPRp组成，其序列信息如下：TBPFp(上游引物)：5’-ACTGCGGGCTCTACTTCATC-3’TBPRp(下游引物)：5’-AGACCGTGGCAGGGAAAC-3’内控引物探针序列信息如下：TBPprobe：5’-CATTCATGCCAACTAC-HBQ1--3’。进一步说，针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四种突变的下游引物为等位基因特异性引物。本专利技术机理:本专利技术结合等位特异性PCR技术(ARMS技术)对现有引物及探针进行改进，采用本专利技术的产品能够达到操作便捷、成本低的效果，而且本专利技术的灵敏度也大大提高了检测，从而可以达到快速准确检测基因突变的目的。等位基因特异性PCR(Allele-SpecificPCR),也称为ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从、引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T，G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故将与突变位点对应的碱基放置在引物的3'末端，同时在必要时人为引入其他碱基的错位配对，便可以达到选择性扩增某种等位基因的作用。从而达到快速准确检测基因突变的目的。本专利技术技术方案带来的有益效果(1)灵敏度高：在本专利技术中，ESR1突变基因在25ng背景基因下的最低检出限为0.1％，相较于传统的技术的1.0％检出限，大大提高了检测的灵敏度(提高了一个数量级)。(2)适用范围广：基于设计中pcr反应的特点，本专利技术可以适用于石蜡包埋组织样本，血浆样本等。(3)特异性强：在本专利技术中，针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四种突变设计的特异性引物具有很高的位点特异性，保证了检测的准确性，避免了假阳性的产生。(4)操作简单，实验时间短。闭管反应，减少了污染的机率。综上所述，本专利技术在产品价格比现有的测序方法低的同时，检出限灵敏度比现有产品高出一个数量级，且适用范围宽。附图说明图1本专利技术试剂盒对血液样本突变检测结果，样本中有突变(FAM通道有信号)。图2本专利技术试剂盒对血液样本内控检测结果。图3是采用本专利技术的实施例1的试验结果。具体实施方式现通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针，其特征在于，包含下列4组下游引物、1组通用上游引物和1组共用阻断探针，具体为：(1)针对ESR1基因Y537S突变的下游引物：Y537S1、Y537S2和/或Y537S3，具体为：Y537S1：5’‑TCTCCAGCAGCAGGTTAG‑3’Y537S2：5’‑TCTCCAGCAGCAGGTAAG‑3’Y537S3：5’‑CTCCAGCAGCAGGTCTG‑3’；(2)针对ESR1基因Y537C突变的下游引物：Y537C1、Y537C2、Y537C3和/或Y537C4，具体为：Y537C1：5’‑CTCCAGCAGCAGGTCTC‑3’Y537C2：5’‑TCTCCAGCAGCAGGTTAC‑3’Y537C3：5’‑CTCCAGCAGCAGGTGAC‑3’Y537C4：5’‑TCTCCAGCAGCAGGTTTC‑3’；(3)针对ESR1基因Y537N突变的下游引物：Y537N1、Y537N2、Y537N3和/或Y537N4，具体为：Y537N1：5’‑TCCAGCAGCAGGTCAAT‑3’Y537N2：5’‑TCCAGCAGCAGGTCACT‑3’Y537N3：5’‑CTCCAGCAGCAGGTCTTT‑3’Y537N4：5’‑CCAGCAGCAGGTCGTT‑3’(4)针对ESR1基因Y538G突变的下游引物：Y538G1、Y538G2、Y538G3和/或Y538G4，具体为：Y538G1：5’‑CATCTCCAGCAGCAGCC‑3’Y538G2：5’‑CATCTCCAGCAGCACGC‑3’Y538G3：5’‑CATCTCCAGCAGCACCC‑3’Y538G4：5’‑GCATCTCCAGCAGCAGCC‑3’；(5)针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突变的通用上游引物Fp1、Fp2、Fp3、Fp4和/或Fp5，序列如下：Fp1：5’‑TAGTCCTTTCTGTGTCTTCCCA‑3’Fp2：5’‑GGCTCGGGTTGGCTCTAA‑3’Fp3：5’‑AGTAACAAAGGCATGGAGCA‑3’Fp4：5’‑TTCCCCTTCTAGGGATTTCAGCACT‑3’Fp5：5’‑ACTCCTGGGGCTCGGGTTGGC‑3’；(6)针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突变的共用阻断探针，该阻断探针的序列及修饰如下：阻断探针：5’‑FAM‑AAGTACGACATGTCTACGA‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光PCR检测ESR1基因突变的引物及探针，其特征在于，包含下列4组下游引物、1组通用上游引物和1组共用阻断探针，具体为：(1)针对ESR1基因Y537S突变的下游引物：Y537S1、Y537S2和/或Y537S3，具体为：Y537S1：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAG-3’Y537S2：5’-TCTCCAGCAGCAGGTAAG-3’Y537S3：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTG-3’；(2)针对ESR1基因Y537C突变的下游引物：Y537C1、Y537C2、Y537C3和/或Y537C4，具体为：Y537C1：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTC-3’Y537C2：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAC-3’Y537C3：5’-CTCCAGCAGCAGGTGAC-3’Y537C4：5’-TCTCCAGCAGCAGGTTTC-3’；(3)针对ESR1基因Y537N突变的下游引物：Y537N1、Y537N2、Y537N3和/或Y537N4，具体为：Y537N1：5’-TCCAGCAGCAGGTCAAT-3’Y537N2：5’-TCCAGCAGCAGGTCACT-3’Y537N3：5’-CTCCAGCAGCAGGTCTTT-3’Y537N4：5’-CCAGCAGCAGGTCGTT-3’(4)针对ESR1基因Y538G突变的下游引物：Y538G1、Y538G2、Y538G3和/或Y538G4，具体为：Y538G1：5’-CATCTCCAGCAGCAGCC-3’Y538G2：5’-CATCTCCAGCAGCACGC-3’Y538...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻德华，刘佳苏，
申请(专利权)人：深圳优圣康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44