本发明专利技术公开了一种多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13的新用途，即其在制备用于结直肠肿瘤早期诊断试剂盒中的应用，该结合位点核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明专利技术提供的CTCF结合位点无论是检测结直肠腺瘤还是结直肠癌的准确性都要显著高于已报道的DNA甲基化分子标记；而且CTCF的DNA结合位点还有可能成为肿瘤治疗效果监测和预后效果评估以及肿瘤分子分型（如CIMP分型）的生物标记。总之，本发明专利技术为寻找更为有效的肿瘤早期诊断、治疗效果监测、预后效果评估以及分子分型的分子标记提供了新的思路，对肿瘤的预防和治疗都具有重要意义。
The application of DNA binding site CTCF_13, a multifunctional transcriptional regulator CTCF
The new use of the invention discloses a multifunctional transcription factor CTCF binding site of DNA CTCF_13, which is used for preparing early diagnosis kit in colorectal cancer, the binding sites of nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shown; the invention provides CTCF binding sites both the accuracy of detection of colorectal adenoma or colorectal cancer should be significantly higher than the DNA methylation markers have been reported; and CTCF DNA binding sites may also be to evaluate the therapeutic effect and prognosis of tumor monitoring effect and tumor molecular typing (CIMP type) biomarkers. In a word, the invention provides a new way to find more effective molecular marker for tumor early diagnosis and treatment evaluation monitoring, prognosis and molecular typing, has important significance for prevention and treatment of tumor.
【技术实现步骤摘要】
多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13的应用
本专利技术公开了一种多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13的应用。
技术介绍
结直肠癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一，其是由结肠上皮细胞中不断积累的遗传学和表观遗传学改变所导致的；每年大概有1235108人被确诊为结直肠癌，每年死亡人数大概为609051人；世界卫生组织估计到2030年，结直肠癌的确诊病例将会新增77%，死亡病例将会新增80%，随着经济的快速发展，结直肠癌在中国的发病率和死亡人数正在逐年上升，结直肠癌的防治形势非常严峻。目前大多数结直肠癌是从腺瘤发展而来的，而且从腺瘤转变为恶性肿瘤的时间大约是10-15年，也就是说在转变为恶性肿瘤之前，我们有10-15年的时间来发现并切除腺瘤从而阻止其恶变。目前，最有效的降低结直肠癌发病率和死亡率的方法就是结直肠癌的早期诊断；因为在结直肠癌早期，病人并没有明显的临床症状，这就导致很多病人在被确诊的时候，已经处于结直肠癌的晚期了，但是在发病初期就对病人进行治疗才是最有效的；通过早期诊断可以在发生癌变前就发现结直肠的病变或者在癌变的早期就发现病情，然后尽可能早的对病人进行有效而系统的治疗，从而有效的降低结直肠癌的发病率和死亡率；早期诊断主要针对的是大量的无症状人群，所以一个理想的早期诊断技术应该是操作简单、成本较低、对病人无创伤以及特异性和敏感性都较高的检测方法。当前临床上应用的最准确的结直肠癌早期诊断方法是结肠镜检查，其缺点是检查费用较高、操作程序较复杂以及病人比较排斥，并不适合在普通人群中大规模推广应用。另一个临床上常用的方法是粪便隐血检查，该方法虽然费用较低，操作起来也比较简单，但是它最大的缺点就是敏感性和特异性不高。表观遗传学分析发现所有的结直肠癌都有几百到几千个基因发生了异常的DNA甲基化，其中一部分基因的异常甲基化与结直肠癌的发病是密切相关的；目前，基于血液的结直肠癌早期诊断方法最有效的就是以SEPT9基因启动子区的DNA甲基化作为生物标记，用该方法对结直肠癌进行早期诊断，可以得到90%的敏感度和88%的特异性，但是该方法对于腺瘤的敏感度和特异性都很低；另外用该方法对50岁以上的无临床症状人群（7941人）进行早期结直肠癌筛查的研究结果显示，虽然特异性能够达到91.5%，但是对于Ⅰ-Ⅳ结直肠癌的敏感度分别只有35%、63%、46%和77.4%。对于腺瘤的敏感度更是只有11.2%；基于粪便的结直肠癌早期诊断方法最成功的应该是以4个基因（BMP3，NDRG4，vimentin和TFPI2）启动子区的DNA甲基化作为生物标记，并同时检测粪便DNA中KRAS基因的突变和粪便中血红蛋白的含量，该方法在特异性为90%的前提下，对于结直肠癌的敏感度为85%，对大于1cm的腺瘤的敏感度为54%；无论是基于血液的方法还是基于粪便的方法，目前都还没有一个特别理想的诊断技术适合在临床上广泛推广应用。值得注意的是，此前的研究基本都是将特定基因启动子区的DNA甲基化作为结直肠癌早期诊断的生物标记，很少有人将关注的目光放在启动子区以外的转录调控区域。基因的启动子就像“开关”，决定基因的活动，控制基因转录的起始时间和表达的程度。但是启动子区以外的转录调控区域同样也会影响基因的转录，很多情况下也会决定基因转录的起始时间和表达的程度，基因启动子区以外的转录调控区域也应该受到同样的关注。CTCF是一种广泛存在于真核生物中的多功能转录因子，为进化上高度保守的多锌指、DNA结合核蛋白。CTCF通过其锌指结构的不同组合，可以选择性识别多种DNA序列，并形成不同的CTCF-DNA复合体，发挥对基因的表达调控作用，具有启动子抑制和激活、基因沉默、增强子阻断、基因印迹调控、X染色体失活等多种生物学功能。CTCF的DNA结合位点在人类基因组是中普遍存在的，大概有5-6万个，每个位点识别大约34个核苷酸；目前还未见将多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点作为结直肠肿瘤早期诊断的生物标记的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13的新用途，即多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13在制备用于结直肠肿瘤早期诊断、筛查和患病风险预测试剂盒中的应用，该结合位点的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术所述检测试剂盒包括常规基因组DNA提取试剂、甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理试剂、进行DNA甲基化检测所需的试剂以及引物对，该引物对能够扩增经亚硫酸氢盐转化过的甲基化或未甲基化的SEQIDNO:1所示序列并对所扩增的序列用DNA质谱法进行后续的DNA甲基化检测。该结合位点CTCF_13在结直肠肿瘤细胞中表现出高甲基化状态，而在正常组织中处于低甲基化状态。所述引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。本申请首次将多功能转录调控因子-CTCF的DNA结合位点作为结直肠肿瘤早期诊断的生物标记。首先，通过分析已发表的CTCF在人类基因组中的DNA结合位点数据，并结合已发表的人类基因组DNA甲基化数据，我们共筛选出了121个位点的CTCF结合模式与DNA甲基化状态存在显著相关性，即这些位点DNA甲基化程度的高低与CTCF结合的多少存在负相关。这121个CTCF结合位点就属于在肿瘤细胞系中特异性的，并且其结合模式与DNA甲基化状态存在显著相关性。第二步，通过高分辨率溶解曲线法（HRM）在33个结直肠肿瘤组织样本及其对应的正常样本中检测了这121个位点的DNA甲基化水平，从中筛选出了23个甲基化模式具有肿瘤特异性的位点。由于HRM法在检测DNA甲基化应用中不能进行准确的定量分析，所以也就不能进一步比较所筛选出的23个位点优劣，所以后续的DNA甲基化检测都是用DNA质谱法完成的；第三步，通过DNA质谱法在20个结直肠肿瘤组织样本及其对应的正常样本中检测了23个位点的DNA甲基化水平，根据这23个位点在区分肿瘤组织和正常组织上的表现，从中筛选出了10个表现最好的位点通过扩大样本作进一步筛选。第四步，通过DNA质谱法在70个结直肠肿瘤组织样本及20个正常样本中检测了10个位点的DNA甲基化水平，根据这10个位点在区分肿瘤组织和正常组织上的表现，选择了5个表现最好的位点在大样本中进行验证。第五步，通过DNA质谱法在295个结直肠肿瘤组织样本及84个正常样本中检测了5个位点的DNA甲基化水平，最终筛选并鉴定出了本申请用于结直肠肿瘤早期诊断分子标记的CTCF结合位点。该位点在结直肠肿瘤细胞中表现出高甲基化状态，而在正常组织中处于低甲基化状态，提示CTCF结合位点CTCF_13的DNA甲基化是结直肠肿瘤早期诊断的分子标记。该结合位点表现出了很高的准确性。在特异性为95%的前提下，它在检测腺瘤、Ⅰ期结直肠癌、Ⅱ期结直肠癌、Ⅲ期结直肠癌和所有结直肠肿瘤中的敏感度分别为79.79%、96.84%、88.06%、87.66%和87.14%。也就是说，CTCF_13检测Ⅰ期结直肠肿瘤的准确性最高（特异性为95%的前提下敏感度为96.84%）。而且，在特异性为95%的前提下，它在检测Ⅰ期结直肠癌、Ⅱ期结直肠癌、Ⅲ期结直肠癌和所有结直肠肿瘤中的敏感度都大于87%，虽然本文档来自技高网...
【技术保护点】
多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13在制备用于结直肠肿瘤早期诊断试剂盒中的应用，该结合位点核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.多功能转录调控因子CTCF的DNA结合位点CTCF_13在制备用于结直肠肿瘤早期诊断试剂盒中的应用，该结合位点核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其包括引物对，所述引物对能够扩增经亚硫酸氢盐转化过的甲基化或未甲基化的SEQIDNO:1所示序列。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。4.多功能转录调控...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘江，唐莉，鲁有望，矣金华，
申请(专利权)人：昆明医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53
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