本发明专利技术公开了一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机‑无机杂化的氨基毛细管整体柱，通过适配体与黄曲霉毒素B1特异性亲和作用，有机‑无机杂化整体柱高的柱渗透性和大的比表面积，可以高灵敏、高选择性地分离、富集复杂食品样品中痕量、超痕量黄曲霉毒素B1，与检测仪器联用可实现黄曲霉毒素B1简便、灵敏、快速检测。
【技术实现步骤摘要】
黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用
本专利技术涉及黄曲霉毒素B1的分离富集方法，具体涉及一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法及应用。
技术介绍
黄曲霉毒素B1（AFB1）是主要由黄曲霉和寄生曲霉等产生的一种有毒代谢产物，已被国际癌症研究机构(IARC)定为一级致癌物。黄曲霉毒素B1广泛分布于各类农产品和食品中，其中最易受到污染的主要有花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。鉴于AFB1的严重危害性，国内外相关组织对其制定了严格的限量标准。目前黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC-MS）、免疫分析法（IA）等。在众多的方法中，HPLC由于操作简单，准确可靠，重复性好，已成为实验室内黄曲霉毒素B1的主要检测方法。但是由于农产品和食品样品基体复杂，在采用HPLC检测黄曲霉毒素B1时，需要对提取液有一个分离纯化的过程。由于相对高的亲和力和特异性，免疫亲和柱在分离纯化和检测分析中得到了广泛的应用。然而，在亲和色谱中，免疫抗体存在一些明显的局限性，（1）抗体在固定相上的固定化仍然具有一定的挑战性，固定的抗体在空间上的取向难以保持一致，影响抗体的亲和力；（2）抗体易受外界条件的影响，在强亲和力的亲和色谱模式下，分离富集操作过程中经常需要改变溶液的pH、添加有机溶剂或变性剂等，剧烈的洗脱条件，可能会导致抗体失活，在很大程度上限制了方法的灵活应用；（3）抗体由于体积大，在固定相表面的覆盖率小，导致免疫亲和柱容量比较小；（4）抗体制备需要经过免疫动物实验或细胞实验、繁琐费时、成本高。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机-无机杂化的氨基毛细管整体柱，用于待测样品中黄曲霉毒素B1的高选择性分离与富集。本专利技术的技术方案如下：一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，包括如下步骤：（1）毛细管活化：用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干。（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mgCTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中。然后将100~200μLTEOS和50~100μLAPTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h。（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管。（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛。（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用3~8mg/ml氰基硼氢化钠冲洗整体柱6h，将制得的毛细管整体柱截取5cm的长度用于之后的固相微萃取操作。上述的毛细管整体柱在分离富集黄曲霉毒素B1中的应用。一种基于上述的毛细管整体柱分离富集黄曲霉毒素B1的方法，它是基于黄曲霉毒素B1的毛细管整体柱选择性捕捉上样液中的黄曲霉毒素B1，实现黄曲霉毒素B1的分离富集；其步骤是：（1）毛细管活化：用10~20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液平衡亲和毛细管整体柱，将亲和毛细管整体柱活化；（2）上样：将待测样品溶液以10~100μL/min通入亲和毛细管整体柱内；（3）清洗：待样品全部流经亲和毛细管整体柱后，用10~20mmol/LTris-HCl缓冲液将柱内残留和未被特异性捕获的黄曲霉毒素B1淋洗下来；（4）洗脱：用含有40~60%甲醇的Tris-HCl缓冲溶液将被亲和毛细管整体柱捕获的黄曲霉毒素B1洗脱。本专利技术的黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机-无机杂化的氨基毛细管整体柱，通过适配体与黄曲霉毒素B1特异性亲和作用，有机-无机杂化整体柱高的柱渗透性和大的比表面积，可以高灵敏、高选择性地分离、富集复杂食品样品中痕量、超痕量黄曲霉毒素B1，与检测仪器联用可实现黄曲霉毒素B1简便、灵敏、快速检测。附图说明图1本专利技术实施例1适配体亲和毛细管整体柱的扫描电子显微镜图；图2本专利技术实施例4整体柱净化后的色谱图。具体实施方式本专利技术在有机-无机杂化毛细管整体柱的表面修饰并结合黄曲霉毒素B1适配体，然后用这种毛细管整体柱去分离富集黄曲霉毒素B1。以下实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，其中的实验条件和设定参数不应视为本专利技术基本技术方案的局限。实施例1黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备（1）毛细管活化：用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干。（2）整体柱的原位合成：首先将25mgCTAB溶于225μL无水乙醇和100μL去离子水的混合溶液中。然后将150μLTEOS和80μLAPTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋30s，然后放置在0℃的冰水浴中超声30s后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于40℃烘箱中反应20h。（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和去离子水充分清洗毛细管，以除去未反应的硅烷试剂和模板剂CTAB。（4）戊二醛衍生：配制含10%戊二醛的100mmol/L磷酸缓冲溶液（pH8.0），将该溶液以5μL/min的速率通入毛细管，连续反应12小时，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛。（5）适配体修饰：将黄曲霉毒素B1适配体溶于100mmol/L磷酸缓冲溶液，配制成5nmol/L的适配体溶液，然后以5μL/min速率通入毛细管，在4℃下反应8h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用5mg/mL氰基硼氢化钠溶液以5μL/min冲洗整体柱6h，将制得的整体柱截取5cm的长度用于之后的固相微萃取操作。上述步骤中，黄曲霉毒素B1适配体的来源于实验室合成，其碱基序列为：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGCTATCATGCGCTCAATGGGAGACTTTAGCTGCCCCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，其中5'端通过C6间隔臂被-NH2修饰。实施例2首先采用与实施例1相同的步骤进行毛细管活化处理。然后，将10mgCTAB溶于150μL无水乙醇和50μL去离子水的混合溶液中，然后将100μLTEOS和50μLAPTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋5min，然后放置在-5℃的冰水浴中超声5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。毛细管两端以硅橡胶封口，放置本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）毛细管活化：分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干；（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mg CTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中；然后将100~200μL TEOS和50~100μL APTES快速加入上述混合溶液中，室温涡旋0.5~5min，然后放置在‑5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中；最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h；（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管；（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛；（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体；最后用3~8mg/ml氰基硼氢化钠冲洗整体柱6h，将制得的毛细管整体柱截取5 cm的长度用于之后的固相微萃取操作。...
【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）毛细管活化：分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干；（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mgCTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中；然后将100~200μLTEOS和50~100μLAPTES快速加入上述混合溶液中，室温涡旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中；最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h；（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管；（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛；（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体；最后用3~8mg/ml氰...
【专利技术属性】
技术研发人员：李彭，方勇，裴斐，姚远航，刘琴，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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