一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，属于色谱科学、细胞生物学及受体药理学领域。该方法将两种不同受体类型的细胞分别制备成细胞膜色谱固定相，再将两种细胞膜色谱固定相混合均匀，得到两种受体类型的混合固定相，最后将混合固定相湿法装柱，构成双靶标细胞膜色谱柱。本发明专利技术制备的双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了活性识别的位点，能够识别复杂体系中“单组分单靶标”、“单组分双靶标”及“多组分双靶标”的目标组分，为多元药物的开发提供新的技术手段，并显著提高复杂体系中目标组分的筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用
本专利技术属于色谱科学、细胞生物学及受体药理学等领域，涉及一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞膜色谱是一种有效的从复杂体系中直接筛选识别目标组分的新技术。但由于中药具有多组分、多作用靶点的特殊性，单靶标细胞膜色谱柱在对复杂体系中目标组分进行筛选时，可能忽略同一组分与不同受体作用，对于不同组分与不同受体作用的筛选效率较低。双靶标细胞膜色谱柱在保持原有单靶标细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了同时活性识别两种不同靶标的可能性，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”目标组分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新技术手段。但目前关于双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法等技术还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，该双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了活性识别的位点，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“双组分/多组分双作用靶标”成分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新的技术手段。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种双靶标细胞膜色谱柱，所述双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，所述双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相是由两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分别包裹大孔硅胶制成的。所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由高表达IgE受体的RBL-2H3细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由高表达MrgprX2受体的LAD2细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由利用基因工程技术构建的高表达EGFR受体的HEK293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由利用基因工程技术构建的高表达FGFR4受体的HEK293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别单组分单靶标、单组分双靶标以及多组分双靶标的目标组分方面的应用。所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别药物中致敏组分及潜在致敏组分方面的应用。所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别复杂体系中抗血管生成抑制剂方面的应用。所述的双靶标细胞膜色谱柱的制备方法，包括以下步骤：1)分别培养两种表达不同受体类型的细胞，当培养的两种细胞计数分别不低于107个时，去除培养基，分别获得两种细胞；2)将获得的两种细胞分别用Tris-HCl混悬后置于细胞超声破碎仪中进行破碎，然后通过差速离心分离出两种细胞的细胞膜；3)用PBS缓冲液将两种细胞的细胞膜分别配制成两种细胞膜悬液，在真空条件下将两种细胞膜悬液分别加入到已预先活化的大孔硅胶内，搅拌均匀后静置过夜，得到两种不同受体的细胞膜色谱固定相；4)将得到的两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合均匀，用装柱机湿法装入柱芯中，即得到双靶标细胞膜色谱柱。所述柱芯的长度为10mm，内径为3.0mm。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：现有的受体高表达细胞膜色谱柱均为单靶标细胞膜色谱柱，仅能用于研究配体与单受体之间的相互作用，且用于筛选目标组分时仅能够识别作用于单靶标的目标组分。本专利技术提供的双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，由于该双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，因此本专利技术提供的双靶标细胞膜色谱柱在保持原有细胞膜色谱柱活性识别和色谱分离特性的基础上，增加了活性识别的位点，显著提高了复杂体系中目标组分的筛选效率，不仅能够识别“单组分与单作用靶标靶”的目标组分，还能够识别“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”的目标组分，对复杂体系中“单组分双作用靶标”及“双/多组分双作用靶标”成分的发现提供了新方法，为多元药物的开发提供了新的技术手段。本专利技术对于药物的安全性评价和新药先导化合物的发现具有重要意义。本专利技术提供的双靶标细胞膜色谱柱的制备方法，将两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分离出来后分别包裹大孔硅胶，制成两种不同受体的细胞膜色谱固定相，再将这两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合均匀后湿法装柱，即得到双靶标细胞膜色谱柱。该方法工艺简单，操作方便。制得的双靶标细胞膜色谱柱能够仿生“单组分双作用靶标”及“多组分双作用靶标”的相互作用，因此在研究配体与受体相互作用时，不仅能够研究配体与单受体的相互作用，还能够研究“单配体与双靶标”及“多配体与双靶标”之间的相互作用，为多元药物的作用过程分析提供了新的技术手段。进一步的，在用于筛选药物的致敏组分时，由于致敏组分可通过IgE-R和MrgprX2两种受体介导类过敏反应，因此现有的单靶标细胞膜色谱柱在筛选药物致敏组分时具有一定的局限性。本专利技术建立的IgE-R&MrgprX2双靶标细胞膜色谱柱能够同时识别药物中能够作用于此两种受体的潜在致敏组分，可用于药物潜在致敏组分的筛选，对于药物的安全性评价具有重要的意义。进一步的，酪氨酸激酶家族中的EGFR和FGFR4是抗血管生成剂的靶受体，通过阻断其磷酸化过程而抑制瘤血管生成。本专利技术制备的EGFR&FGFR4双靶标细胞膜色谱柱，能够用于中药等复杂体系中抗血管生成抑制剂的筛选，可同时对EGFR和FGFR4的配体进行筛选，显著提高了筛选效率，与此同时也有助于发现同时作用于EGFR和FGFR4的目标组分，对于多元药物的开发具有重要意义。进一步的，本专利技术中双靶标细胞膜色谱柱选用的色谱柱规格为10mm(L)×3.0mm(I.D.)，较之现有的细胞膜色谱柱规格10mm(L)×2.0mm(I.D.)，提高了色谱柱的容量，提高了柱效，提高了复杂体系中微量组分的识别效率。附图说明图1为槲皮素和环丙沙星的混合对照溶液在三种细胞膜色谱柱上的色谱图，其中A为IgE-R&MrgprX2双靶标细胞膜色谱柱，B为IgE-R细胞膜色谱柱，C为MrgprX2细胞膜色谱柱；图2为丹参超临界提取物在EGFR&FGFR4双靶标细胞膜色谱柱上的色谱图，包含保留组分R1&R2。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术提供一种双靶标细胞膜色谱柱及其制备方法。贴壁生长的受体高表达细胞通过消化、差速离心制备得到细胞膜，然后将细胞膜与硅胶充分混合，利用大孔硅胶的吸附作用及细胞膜的流动性将细胞膜包裹在硅胶表面，得到细胞膜色谱固定相。将两种不同受体高表达的细胞膜色谱固定相混合均匀，得到两种受体类型的混合固定相，再通过湿法装入色谱柱中，构成一种双靶标细胞膜色谱柱。该双靶标细胞膜色谱柱增加了活性识别的位点，能够识别筛选出“单组分单靶标”、“单组分双靶标”及“多组分双靶标”目标组分，显著提高复杂体系中目标组分的筛选效率，并为多元药物的开发提供新的技术手段。本专利技术中双靶标细胞膜色谱柱的制备方法包含以下操作：1)细胞膜色谱固定相的制备将培养的细胞计数不低于(107个)，利用0.25％胰蛋白酶消化，3000g4℃条件下离心10min，去除培养基取沉淀物，加入10mmol/L的PBS缓冲液重新混悬并于3000g4℃条件下离心10min，吸取细胞表面残留的培养基，重复3次，将培养好的细胞分离出来。然后用5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双靶标细胞膜色谱柱，其特征在于：所述双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，所述双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相是由两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分别包裹大孔硅胶制成的。

【技术特征摘要】
1.一种双靶标细胞膜色谱柱，其特征在于：所述双靶标细胞膜色谱柱中填充有双靶标细胞膜色谱固定相，所述双靶标细胞膜色谱固定相是由两种不同受体的细胞膜色谱固定相混合而成的，所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相是由两种表达不同受体类型的细胞的细胞膜分别包裹大孔硅胶制成的。2.根据权利要求1所述的双靶标细胞膜色谱柱，其特征在于：所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由高表达IgE受体的RBL-2H3细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由高表达MrgprX2受体的LAD2细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。3.根据权利要求1所述的双靶标细胞膜色谱柱，其特征在于：所述两种不同受体的细胞膜色谱固定相，一种是由利用基因工程技术构建的高表达EGFR受体的HEK293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的，另一种是由利用基因工程技术构建的高表达FGFR4受体的HEK293细胞的细胞膜包裹大孔硅胶制成的。4.权利要求1所述的双靶标细胞膜色谱柱在筛选识别单组分单靶标、单组分双靶标以及多组分双靶标的目标组分方面的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺浪冲，韩省力，张涛，吕艳妮，马维娜，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61