一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法，包括如下步骤：(1)靶向

Method for realizing site-specific integration of large fragments of DNA in mammalian cells by using CRISPR/Cas9

The invention discloses a method for realizing site-specific integration of a large fragment of DNA in mammalian cells by using CRISPR/Cas9, comprising the following steps: (1) targeting;

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法
本专利技术涉及基因工程
，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法。
技术介绍
哺乳动物细胞基因组中进行大片段外源基因的定点整合，通常采用的是双交换同源重组的方法，该技术的实施步骤为通过构建包含目的基因两侧的两个同源臂的打靶供体，利用两个同源臂与目的基因进行双交换同源重组，从而将目的基因替换成两个同源臂之间的外源DNA片段来实现的。但是该技术存在如下不足：双交换同源重组的效率往往较低，一般为10-6；采用该技术实现定点整合的外源DNA片段相对较小，一般为2kb以下。具体原因可能是因为两个同源臂的物理距离越大越不利于在目的基因两侧同时进行同源重组交换的发生导致。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法。本专利技术能实现约6kb大片段在哺乳动物细胞中的定点整合。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点定向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点定向整合的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)靶向

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点定向整合的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)靶向CCR5基因的CRISPR/Cas9打靶系统的构建：打靶系统由Cas9/sgRNA表达载体和打靶供体组成，所述打靶供体包括启动子、荧光标记基因、中间含有gRNA靶序列的与目的基因的同源序列的设计；(2)CRISPR/Cas9打靶系统共转染哺乳动物细胞，转染后分选稳定表达荧光的细胞，进行单细胞克隆培养；(3)单细胞克隆PCR鉴定检测定点整合效率，获得高效定点定向整合的哺乳动物细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向CCR5基因的CRISPR/Cas9靶向位点序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翔，何祖勇，刘小凤，刘小红，陈瑶生，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44