利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法技术方案

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及通过稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑从而改变其遗传特性的方法。针对现有的病毒基因组编辑技术的不足，本发明专利技术提供一种利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑的方法，包括如下步骤：首先构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体，然后包装慢病毒，再用慢病毒侵染ST细胞与293T细胞获得稳转CRISPR/Cas9系统的ST细胞与293T细胞，最后用病毒侵染这种稳转细胞，并纯化出基因组被编辑的病毒。利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组操作简单、效率高、成本低、适用范围广，能在短时间内获得基因改良型的病毒株。

【技术实现步骤摘要】
利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及通过稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑从而改变其遗传特性的方法。
技术介绍
基因编辑技术是指可以根据人们的意愿对目的基因进碱基的插入或者缺失，以改变物种遗传特性为目的的技术手段。早期的基因编辑技术主要包括以ZFN(zinc-fingernucleases)和TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术，其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。CRISPR/Cas9系统是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。其在sgRNA的引导下能对目的基因进行切割，被切割的基因在进行修复时可能会引起碱基的缺失或者插入从而使目的基因突变。CRISPR/Cas9技术源于细菌的一种获得性免疫系统。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats-成簇的规律间隔的短回文重复序列)。细菌在抵抗病毒或外源核酸入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。目前，获得基因改良的病毒株的方法主要有以下几种：第一，通过将病毒在体外培养进行反复传代的方法。这种方法可以获得自然突变的病毒，但是这种突变的位点是未知的；而且突变对病毒的致病能力的改变是不确定的，可以是增强也可以是减弱。这种方法分离的突变型病毒其回复突变能力强而且耗时极少人会采用。第二，利用反向遗传学技术手段获得改良型病毒。使用该方法的前提是对病毒的基因组每个基因的功能以及其碱基序列的了解。其主要过程是在体外将病毒的关键性基因连接到特定的载体上，再将这些载体共转染到特定的细胞中进行共表达。在细胞中表达的病毒蛋白可以自行包装成病毒颗粒。这种方法可以特异性的删除病毒的基因或者引入外源基因，其局限性在于只能对遗传特性已知的病毒进行改良，对未知病毒不具有编辑能力且步骤繁琐成功率不高。第三，借助CRISPR/Cas9系统对病毒基因进行编辑。利用CRISPR/Cas9系统编辑基因，通常是将CRISPR/Cas9系统通过一个质粒载体瞬转到细胞中以达到编辑细胞中特定的基因，该基因也可以是细胞内病毒的基因组。这种瞬转的方法操作最为简单，但是编辑细胞内病毒基因组的效率不高，往往在试验中要进行多次瞬转才能达到比较好的效果且价格昂贵。另一个利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑基因是通过慢病毒介导的，首先包装慢病毒，将包装好的慢病毒去侵染特定的细胞。慢病毒侵染细胞后会将自己的基因组完全整合到宿主细胞的基因组中，而慢病毒的基因组中就包含有CRISPR/Cas9系统。这样CRISPR/Cas9系统就整合到宿主细胞中并且永不丢失。将要编辑的病毒感染稳转了CRISPR/Cas9系统的细胞，这样该病毒就会被编辑。利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组操作简单、效率高、成本低、适用范围广，能在短时间内获得基因改良型的病毒株。现在国内外利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的研究还比较少。
技术实现思路
本专利技术针对现有的病毒基因组编辑技术的不足，提供一种稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的方法。本专利技术所获得的稳转CRISPR/Cas9系统的293T细胞株与ST细胞株。本专利技术获得一株gE基因缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE-)与一株gE、TK基因双缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE-/TK-)。本专利技术采用如下技术方案：一种稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的方法，包括以下步骤：(1)构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体；(2)包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株；(3)用病毒侵染稳转细胞株；(4)纯化出基因组被编辑的病毒。其中步骤(1)所述构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体的方法为：设计用于起特异性靶向作用的sgRNA并将其连接到经BsmBI酶切后的载体LentiCRISPRV2上，得到LentiCRISPRV2-sgRNA。步骤(2)所述包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株的具体方法如下：将靶向编辑病毒基因组的特异性载体与pCMV-VSV-G、pSPAX2质粒共转染到293T细胞进行慢病毒的包装并收获慢病毒，将收获的慢病毒侵染ST细胞与293T细胞，最终通过Puromycin进行筛选获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。步骤(3)所述用病毒侵染稳转细胞株的具体方法为：首先将野生型病毒扩大培养并测其滴度，然后加入到培养的稳转细胞株中；待细胞病变达到80％以上时收获病毒并将该次病毒液作为下一次侵染稳转细胞的毒液；每收获一次都进行测序用于判定突变病毒与野生型病毒的比例以及是否需要进行下一次侵染。更具体地，其中野生型病毒毒量为107TCID50。步骤(4)所述纯化出基因组被编辑的病毒是采用病毒噬斑法，具体方法如下：取ST细胞进行铺板待细胞汇合度达到80％以上时加入步骤(3)得到的被修饰过的病毒，加入病毒后继续培养并观察噬斑的形成，挑取噬斑并扩大培养以及测序鉴定。更具体地，被修饰过的病毒滴度为105TCID50。所述病毒为伪狂犬病毒PRV；所述特异性靶向作用的sgRNA为用于靶向伪狂犬病毒PRVgE基因的sgRNA和靶向伪狂犬病毒PRVTK基因的sgRNA。其中用于靶向PRVgE基因的sgRNA：GCCGGCGACGATGACCTCGA，靶向PRVTK基因的sgRNA：TGCCCGAGCCGATGGCGTAC。根据以上方法纯化出一株gE基因缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE-)与一株gE、TK基因双缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE-/TK-)，毒力下降，可用于制备疫苗。本专利技术的优点在于：1、利用慢病毒侵染细胞可以获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。该细胞能够稳定持续表达Cas9蛋白以及转录sgRNA。用该细胞株编辑病毒的基因组避免了瞬转效率不高，以及瞬转后随着细胞的增值、质粒的降解所造成质粒丢失的现象。2、用稳转细胞株编辑病毒的基因组，相对于瞬转其避免了多次的转染操作从而能达降低成本的目的。3、相对于反向遗传学技术利用CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组，不需要知道该病毒的所有序列，只需要知道其中一小段序列就可以实现对病毒基因组的编辑。4、用稳转细胞株编辑病毒的基因组操作简单能在短时间内获得基因被修饰的病毒株。附图说明图1为LentiCRISPRV2载体的酶切产物电泳结果。图2为连接敲除TK基因sgRNA的测序结果。图3为连接敲除gE基因sgRNA的测序结果。图4为慢病本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：所述方法包括的步骤如下：(1)构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体；(2)包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株；(3)用病毒侵染稳转细胞株；(4)纯化出基因组被编辑的病毒。

【技术特征摘要】
1.利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：所述方法包括的步骤如下：(1)构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体；(2)包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株；(3)用病毒侵染稳转细胞株；(4)纯化出基因组被编辑的病毒。2.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(1)所述构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体的方法为：设计用于起特异性靶向作用的sgRNA并将其连接到经BsmBI酶切后的载体LentiCRISPRV2上，得到LentiCRISPRV2-sgRNA。3.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(2)所述包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株的具体方法如下：将靶向编辑病毒基因组的特异性载体与pCMV-VSV-G、pSPAX2质粒共转染到293T细胞进行慢病毒的包装并收获慢病毒，将收获的慢病毒侵染ST细胞与293T细胞，最终通过Puromycin进行筛选获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。4.如权利要求3所述方法获得的稳转细胞株，其特征在于：所述稳转细胞株为稳转CRISPR/Cas9系统的29...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆龙，丰志华，陈骐，余文权，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35