通过使用缓冲液预处理提高琼脂中单糖生产产率的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过使用缓冲液预处理来改善琼脂中单糖的生产产率的方法，并且通过使用琼脂代替琼脂糖作为初始底物，使用缓冲液作为预处理溶液，并依次使用琼脂酶、琼脂糖分解β‑半乳糖苷酶和α‑新琼脂二糖水解酶作为酶水解中使用的酶，而具有有效改善作为单糖的3,6‑脱水‑L‑半乳糖和半乳糖的生产产率的效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过使用缓冲液预处理提高琼脂中单糖生产产率的方法
本专利技术涉及一种使用缓冲液作为预处理溶剂以从琼脂中酶促产生单糖来改善单糖例如3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法。
技术介绍
海藻与目前在各种领域中使用的木质纤维素或草本生物质相比，具有低含量的不适用的组分例如木质素等，因此能够转化为单糖，其是用于更容易生产生物能源和生物化学的原材料。此外，由于海藻不使用生物质资源，因此它们也没有由于生物质资源的增能而引起的问题。由于这样的原因，海藻作为生物化学以及替代能量的生产中的重要生物质已经受到关注(Wi等,BioresourTechnol,100(2009),第6658-6660页)。特别地，已经报道红藻(例如，苍耳(Gelidiumamansii))是用于产生这样的生物能和生物化学物质的来源，并且还高度适用于医疗和化妆品领域，因为其成分琼脂低聚糖具有优异的生理特性，例如抗氧化、抗炎症、抗癌、抗过敏、美白、保湿活性等(Tomono等，美国专利No.76622291(2009),Enoki等，美国专利No.691143282(2005),Chen等，FoodTechnolBiotechnol.43(1)第29-36页(2005),Chen等，NutJ.5(31)第1-12(2006))。红藻具有琼脂糖作为主要成分，其是由α-1,3键连接3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖作为基本单元的新琼脂二糖的聚合物，其通过β-1,4键相互连接。专利技术人通过实验证明，包括新琼脂二糖的琼脂低聚糖的生理功能是由3,6-脱水-L-半乳糖引起的(Yun等，ApplMicrobiolBiotechnol.97(7)第2961-70页(2013))。此外，通过温和的化学预处理代替化学处理来生产3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖的方法(Jol等，AnalBiochem.268,第213-222页(1999),Kim等，BullKoreanSoc.31(2)第511-514页(2010))，其在3,6-脱水-L-半乳糖的生产中具有非常低的产率和容易过度降解的问题，并且已经报道了酶糖化(韩国专利公开号2013-0085017)。琼脂低聚糖通过Aga50D降解为主要反应产物即新琼脂二糖和新琼脂三糖(D-半乳糖-β-1,4连接-3,6-脱水-L-半乳糖-α-1,3连接-D-半乳糖)，所述Aga50D是在化学预处理后处理的外切型琼脂酶。之后，新琼脂二糖通过α-新琼脂二糖水解酶SdNABH最终水解成3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖(韩国专利公开号2010-0108241)。在该方法中，虽然预处理对于提高Aga50D的反应性是必要的，但是目前使用的用弱酸的温和化学预处理方法需要中和或冻干以用于随后的酶反应，从而产生大量的中和中产生的盐以及相当数量的处理费用。此外，当进行化学预处理时，主要降解3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1,3键，并且当处理外切型β-琼脂酶时，最终保留琼脂三糖，而不降解成3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖，这也成为降低单糖的生产产率的原因。此外，到目前为止，在3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖的生产中，琼脂糖已经用作初始底物，并且通过重复数次的分离和纯化过程由红藻产生，因此是昂贵的。因此，需要开发能够简化整个过程、降低整个过程的成本并提高单糖的生产产率的工艺技术。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术的目的是提供一种通过使用琼脂作为底物来提高单糖例如3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法，以简化生产过程并降低生产的单位成本，并且适当地使用预处理溶剂和在酶水解中使用的水解酶。[技术方案]为了实现该目的，本专利技术提供了一种用于提高3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法，其包括：用pH6至9的缓冲液预处理琼脂；以及用琼脂酶、琼脂糖分解β-半乳糖苷酶(agarolyticβ-galactosidase)和α-新琼脂二糖水解酶顺序地水解经预处理的琼脂。[有益效果]本专利技术具有有效地提高单糖例如3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的效果，其通过使用比琼脂糖便宜的琼脂作为初始底物和使用缓冲液作为预处理溶剂，并且依次应用琼脂酶、琼脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新琼脂二糖水解酶作为酶水解所用的酶，大大减少了在预处理琼脂的中和中产生的盐的量，降低了生产的单位成本并简化了生产工艺。附图说明图1显示了作为底物的预处理琼脂和通过与酶反应获得的产物的薄层色谱(TLC)结果：Std是标准，使用3,6-脱水-L-半乳糖(AHG)、新琼脂二糖(DP2)、半乳糖(Gal)和琼脂三糖(DP3)，道1是预处理的琼脂，道2是用琼脂酶(Aga50D)处理预处理琼脂获得的产物，道3是用琼脂糖分解β-半乳糖苷酶(ABG)处理琼脂酶产物获得的产物，道4是用α-新琼脂二糖水解酶(NABH)处理琼脂糖分解β-半乳糖苷酶产物获得的产物，道5是用NABH而没有用ABG处理琼脂酶产物获得的产物。图2显示了使用琼脂糖分解β-半乳糖苷酶(ABG)通过高效液相色谱法(HPLC)获得的3,6-脱水-L-半乳糖的生产产率的定量分析结果。图3显示了使用琼脂糖分解β-半乳糖苷酶(ABG)通过HPLC获得的D-半乳糖的生产产率的定量分析结果。具体实施方式下面将详细描述本专利技术的构造。在说明书中描述数值范围时，术语“至”应当被理解为包括每个数值范围的阈值。例如，应当注意，pH6至9是包括pH6和pH9的数值范围。本专利技术涉及一种提高3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法，其包括：用pH6至9的缓冲液预处理琼脂；以及用琼脂酶、琼脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新琼脂二糖水解酶顺序地水解经预处理的琼脂。根据本专利技术的用于提高3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法的特征在于，通过使用比琼脂糖便宜的琼脂作为初始底物，用缓冲液作为预处理溶剂预处理底物，并使经预处理的琼脂与外切型琼脂酶例如Aga50D、琼脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新琼脂二糖水解酶顺序地反应，从而由水解产物获得单糖例如3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的高生产产率。下面将逐步详细描述根据本专利技术的用于提高3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法。第一步是用缓冲液预处理琼脂。缓冲液用于满足琼脂的酶水解的最佳要求，并且当被预处理时，即用水作为预处理溶剂加热时，由于胶凝效应难以实现酶水解。因此，将缓冲液加入到琼脂中以防止这种胶凝效应，并且作为缓冲液，可以使用特别地pH6至9的溶液，更特别地pH7至8的一种或至少两种中性溶液，例如Tris-HCl、乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、甘氨酸-NaOH等。琼脂在缓冲液中的浓度优选为0.1至5％。例如，当缓冲液为20mL时，可以加入0.02至1g的琼脂。在上述范围内，可以有效地从琼脂中生产琼脂低聚糖。为了有效地从琼脂中生产琼脂低聚糖，用缓冲液的预处理可以在100至200℃下进行1分钟至1小时。此外，根据本专利技术的用于提高3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法可以还包括对预处理琼脂的中和。中和是为了满足酶水解的最佳条件，或换句话说，使预处理产物的pH为中性，即滴定至pH6至8。作为滴定溶剂，可以使用NaOH、氢氧化铵或盐酸(HCl)等，但本专利技术不限于此。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于改善3,6‑脱水‑L‑半乳糖和半乳糖的生产产率的方法，其包括：用pH 6至pH 9的缓冲液预处理琼脂；以及用琼脂酶、琼脂糖分解β‑半乳糖苷酶和α‑新琼脂二糖水解酶顺序地水解经预处理的琼脂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.01 KR 10-2014-01324011.一种用于改善3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的生产产率的方法，其包括：用pH6至pH9的缓冲液预处理琼脂；以及用琼脂酶、琼脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新琼脂二糖水解酶顺序地水解经预处理的琼脂。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液选自由Tris-HCl、乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠和甘氨酸-NaOH组成的组中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在预处理中的缓冲液中，所述琼脂的浓度为0.1％至5...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，崔仁杰，李赞炯，尹银珠，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR