经修饰的酶制造技术

技术编号：16110460 阅读：37 留言：0更新日期：2017-08-30 03:57

本发明专利技术涉及修饰的Dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于对多核苷酸进行测序。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的酶
本专利技术涉及一种修饰的Dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于测序多核苷酸。
技术介绍
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。当跨纳米孔施加电势时，在，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
技术实现思路
令人出乎意料的是，专利技术人已经鉴定出特异性Dda突变体，该突变体具有提升的能力以控制多核苷酸穿过孔的移动。本专利技术的突变体显示减少的向前滑移(slipping)。这是DNA通过至少4个连续核苷酸并且通常通过超过10个连续核苷酸相对孔向前移动的现象。向前滑移可能涉及100个或更多个连续的核苷酸的向前移动，这对于每个多核苷酸可能发生多次。对于多核苷酸测序，向前滑移可能是有问题的。由专利技术人鉴定的突变体通常包含突变的组合，即(1)与单链DNA(ssDNA)中的核苷酸相互作用的氨基酸的一个或多个取代，和(2)与跨膜孔相互作用的突变体的一部分上的一个或多个修饰。因此，本专利技术提供了一种DNA依赖...
经修饰的酶

【技术保护点】
一种DNA依赖性ATPase(Dda)解旋酶，其中：(a)至少一个与单链DNA(ssDNA)中一个或多个核苷酸相互作用的氨基酸被取代；和(b)与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括一个或多个修饰，其中，所述解旋酶具有控制多核苷酸移动的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.07 GB 1417712.5;2015.05.01 GB PCT/GB2015/01.一种DNA依赖性ATPase(Dda)解旋酶，其中：(a)至少一个与单链DNA(ssDNA)中一个或多个核苷酸相互作用的氨基酸被取代；和(b)与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括一个或多个修饰，其中，所述解旋酶具有控制多核苷酸移动的能力。2.根据权利要求1所述的解旋酶，其中，在(a)中，用包含较大侧链(R基团)的氨基酸取代至少一个与单链DNA(ssDNA)中一个或多个核苷酸的糖和/或碱基相互作用的氨基酸。3.根据权利要求2所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括：(a)SEQIDNO:8的变体，其中，所述至少一个与ssDNA中一个或多个核苷酸的糖和/或碱基相互作用的氨基酸是H82,N88,P89,F98,D121,V150,P152,F240,F276,S287,H396和Y415中的至少一个；或者(b)SEQIDNO:9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23的变体，其中,所述至少一个与ssDNA中一个或多个核苷酸的糖和/或碱基相互作用的氨基酸是与SEQIDNO:8中的H82,N88,P89,F98,D121,V150,P152,F240,F276,S287,H396和Y415相对应的氨基酸中的至少一个。4.根据权利要求2或3所述的解旋酶，其中，所述至少一个与ssDNA中一个或多个核苷酸的糖和/或碱基相互作用的氨基酸是至少一个插入在ssDNA中的核苷酸之间的氨基酸。5.根据权利要求4所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括：(a)SEQIDNO:8的变体，其中，所述至少一个插入在ssDNA中的核苷酸之间的氨基酸是P89,F98和VI50中的至少一个；或者(b)SEQIDNO:9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23的变体，其中,所述至少一个插入在ssDNA中的核苷酸之间的氨基酸是与SEQIDNO:8中的P89,F98和VI50相对应的氨基酸中的至少一个。6.根据权利要求2至5中任一项所述的解旋酶，其中，所述较大侧链(R基团)包括增加数目的碳原子，具有增加的长度，增加的分子体积和/或具有增加的范德华体积。7.根据权利要求2至6中任一项所述的解旋酶，其中，所述较大侧链(R基团)增加了所述至少一个氨基酸与所述ssDNA中一个或多个核苷酸之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi(阳离子-π)相互作用。8.根据权利要求2至7中任一项所述的解旋酶，其中，包含较大侧链(R基团)的氨基酸不是丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、硒代半胱氨酸(U)、甲硫氨酸(M)、天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。9.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中组氨酸(H)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；天冬酰胺(N)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；脯氨酸(P)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)或组氨酸(H)；(iii)酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)或(iv)亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)取代；苯丙氨酸(F)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)组氨酸(H)或(iii)酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；天冬氨酸(D)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；缬氨酸(V)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)；(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)或(iv)异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代；丝氨酸(S)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)；(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)或(iv)异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代；和/或酪氨酸(Y)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)或(iii)色氨酸(W)取代。10.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶是SEQIDNO:8的变体，并且包含：11.根据权利要求2至7中任一项所述的解旋酶，其中，具有较大侧链(R基团)的氨基酸是非天然氨基酸。12.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，在(a)中，至少一个与单链DNA(ssDNA)中一个或多个核苷酸的一个或多个磷酸基团相互作用的氨基酸被取代。13.根据权利要求12所述的解旋酶，其中，所述取代增加了所述至少一个氨基酸和所述ssDNA中一个或多个磷酸基团之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi(阳离子-π)相互作用。14.根据权利要求13所述的解旋酶，其中，所述取代增加了位点的净正电荷。15.根据权利要求12至14中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包括：(a)SEQIDNO:8的变体，其中，所述至少一个与ssDNA中一个或多个核苷酸的一个或多个磷酸基团相互作用的氨基酸是H64,T80,S83,N242,K243,N293,T394和K397中的至少一个；或者(b)SEQIDNO:9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23的变体，其中，所述至少一个与ssDNA中一个或多个核苷酸的一个或多个磷酸基团相互作用的氨基酸是与SEQIDNO:8中的H64,T80,S83,N242,K243,N293,T394和K397相对应的至少一个氨基酸。16.根据权利要求15所述的解旋酶，其中组氨酸(H)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或苏氨酸(T)；(iii)苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)取代；苏氨酸(T)被(i)精氨酸(R)、组氨酸(H)或赖氨酸(K)；(ii)天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)取代；丝氨酸被(i)精氨酸(R)、组氨酸(H)或赖氨酸(K)；(ii)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)取代；天冬酰胺(N)被(i)精氨酸(R)、组氨酸(H)或赖氨酸(K)；(ii)丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)取代；和/或赖氨酸(K)被(i)精氨酸(R)或组氨酸(H)；(ii)天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)取代。17.根据权利要求12至16中任一项所述的解旋酶，其中，所述氨基酸被非天然氨基酸取代。18.根据权利要求12至17中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶是SEQIDNO:8的变体，其包含一个或多个的(a)H64N,H64Q,H64K或H64F；(b)T80K,T80Q或T80N；(c)S83H,S83N,S83K,S83T,S83R或S83Q(d)N242H或N242Q；(e)K243Q或K243H；(f)N293Q,N293K或N293H；(g)T394K,T394H或T394N和(h)K397R,K397H或K397Y。19.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶是SEQIDNO:8的变体，其包含以下位点上的取代：-F98/H64，例如F98W/H64N，F98W/H64Q，F98W/H64K或F98W/H64F；-F98/T80，例如F98W/T80K，F98W/T80Q，F98W/T80N；-F98/H82，例如F98W/H82N，F98W/H82Q或F98W/H82W；-F98/S83，例如F98W/S83H，F98W/S83N，F98W/S83K，F98W/S83T，F98W/S83R或F98W/S83Q；-F98/N242，例如F98W/N242H，F98W/N242Q，F98W/K243Q或F98W/K243H；-F98/N293，例如F98W/N293Q，F98W/N293K，F98W/N293H，F98W/T394K，F98W/T394H，F98W/T394N，F98W/H396Y，F98W/H396F，F98W/H396Q或F98W/H396K；或者-F98/K397，例如F98W/K397R，F98W/K397H或F98W/K397Y。20.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶包含(a)SEQIDNO:8的变体，并且与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括SEQIDNO:8中的位点1,2,3,4,5,6,51,176,177,178,179,180,181,185,189,191,193,194,195,197,198,199,200,201,202,203,204,207,208,209,210,211,212,213,216,219,220,221,223,224,226,227,228,229,247,254,255,256,257,258,259,260,261,298,300,304,308,318,319,321,337,347,350,351,405,415,422,434,437,438；(b)SEQIDNO:8的变体，并且与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括SEQIDNO:8中的位点1,2,4,51,177,178,179,180,185,193,195,197,198,199,200,202,203,204,207,208,209,210,211,212,216,221,223,224,226,227,228,229,254,255,256,257,258,260,304,318,321,347,350,351,405,415,422,434,437和438；(c)SEQIDNO:8的变体，并且与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括SEQIDNO:8中的位点1,2,178,179,180,185,195,197,198,199,200,202,203,207,209,210,212,216,221,223,226,227,255,258,260,304,350和438...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·海伦，瑞贝卡·维多利亚·鲍恩，马克·布鲁斯，拉科马·贾亚辛格，约瑟夫·哈格里夫·劳埃德，绍博尔奇·苏罗尔斯，伊丽莎白·杰恩·华莱士，克里斯多夫·彼得·约德，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB

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