修饰植物中酶的活性制造技术

本发明专利技术针对的是在植物中靶向基因和基因组、修饰酶活性及蛋白质表达。具体而言，本发明专利技术涉及用于降低植物细胞中一种或多种内源糖基转移酶如N-乙酰葡萄糖氨基转移酶、β(1,2)-木糖基转移酶及α(1,3)-岩藻糖基转移酶的活性的方法，并涉及由所述方法获得的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰植物中酶的活性本专利技术针对的是修饰对植物中具体酶的活性。具体而言，本专利技术涉及用于在降低、 抑制或基本上抑制植物中一种或多种内源糖基转移酶的活性，以及通过所述方法获得的植物细胞和植物。植物和哺乳动物中的N-糖基化过程有很多方面都是类似的，这些过程一般包括大量的顺序酶步骤。然而，植物糖蛋白和哺乳动物糖蛋白的成熟N-聚糖结构之间的关键差异在于所述过程的最后步骤中所添加的具体单糖不同。植物产生的蛋白质的成熟N-聚糖链一般包含α-1，3-连接的岩藻糖残基(α (1，3)_岩藻糖)和β _1，2_连接的木糖残基 (β (I, 2)-木糖)，二者在哺乳动物N-聚糖中都不存在。一般地，N-糖基化以将前体Glc3-Man9-GlcNAc2寡糖添加于糖基化的蛋白质的天冬氨酸残基而开始，然后在内质网(ER)中由大量酶对其进行顺序加工，以三种葡萄糖苷酶开始(葡萄糖苷酶1、葡萄糖苷酶II和葡萄糖苷酶III)并产生Man9-GlcNAc2-Asn N-聚糖。 随后，甘露糖苷酶I酶将富含甘露糖的Man9-GlcNAc2-Asn N-聚糖剪切为Man5-GlcNAc2-Asn N-聚糖。然后将这种糖基化的蛋白质从ER转运到顺面高尔基网。转运是通过囊泡和膜融合介导的。ER衍生的囊泡从ER膜上出芽并融合入顺面高尔基网。真核细胞中的 Man5-GlcNAc2-Asn N-聚糖随后在高尔基体中多个区室内通过大量N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、甘露糖苷酶和糖基转移酶的作用而成熟。在哺乳动物(包括人)中，糖基化过程的最后步骤中，岩藻糖以α-1，6_连接 (α (1，6)_岩藻糖)加至N-聚糖的非还原性末端的邻近N-乙酰葡萄糖胺残基上。在植物中，α-1,3-连接(a (1,3)-岩藻糖)中的岩藻糖和β _1，2连接(β (1,2)-木糖)中的木糖被加至N-聚糖。岩藻糖残基是通过岩藻糖基转移酶的作用加至N-聚糖链的。更具体地，在植物中，ct -1, 3-连接的岩藻糖(α (I, 3)-岩藻糖)是通过α -1, 3_岩藻糖基转移酶 (α (I, 3)_岩藻糖基转移酶)添加的；木糖是通过β -1, 2-木糖基转移酶(β (I, 2)_木糖基转移酶)以β-1，2-连接(β (1，2)-木 糖)加至三甘露糖基(Man3)核心结构的β_1，4_连接的甘露糖(β (I, 4)-Man)上的。这些碳水化合物在植物产生的蛋白质表面的存在影响到当其被引入动物中时所述蛋白质的免疫原特性。因此不同的糖基化形式为植物产生的蛋白质在哺乳动物(包括人)中的治疗用途提出了一个难题，并且可能影响对所述蛋白质的监管许可。蛋白质如可治疗性地用于人的蛋白质的重组表达构成转基因动物的一项重要的应用。人们已经考虑过使用烟草植物用于生产重组蛋白质。然而，烟草植物的基因组非常复杂。例如，烟草(Nicotiana tabacum)是一种异源四倍体物种,被认为是樟子松烟草 (Nicotiana sylvestris)和鸾毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)之间种内杂交的双二倍体，其具有48条染色体。对于每个基因(包括编码糖基转移酶的基因)都预期存在多种不同的等位基因和变体。进一步地，烟草具有迄今已知的最大的基因组(约4500万个碱基对)之一，包含分散在超过70%的“垃圾DNA中的30，000-50, 000个基因。因此，烟草基因组的大小和复杂度对基因发现、等位基因和变体鉴别以及具体等位基因或变体的靶向修饰提出了极大的挑战。考虑到在植物特别是烟草植物中产生重组蛋白质的潜力，因此需要鉴别在蛋白质糖基化过程中有活性的不同内源糖基转移酶的方法，和降低、抑制或基本上抑制所述一种或多种所述糖基转移酶的活性的方法。具体地，可取的是获得能够产生蛋白质的植物和植物细胞，所述蛋白质在其N-聚糖中几乎缺少α-1，3-连接的岩藻糖残基、β-1 ,2-连接的木糖残基或二者。因此这些植物产生的蛋白质可具有有利的免疫原特性可以用于人。本专利技术的一个目标是解决这些需求。在本专利技术的多种实施方式中，提供了(i)用于鉴别编码糖基转移酶的基因序列及其片段，以及这些基因序列的变体和等位基因的方法，(ii)用于修饰这些基因序列的方法， 以及(iii)用于降低、抑制或基本上抑制这些序列编码的糖基转移酶的酶活性的方法。还提供了编码糖基转移酶及其变体和等位基因的多核苷酸，以及其片段和突变体。本专利技术还包含了用于修饰糖基转移酶基因序列的靶标位点，以及用于在植物细胞中修饰糖基转移酶基因序列的组合物，例如但不限于，包含锌指结构域的蛋白质。本专利技术还提供了植物细胞或植物用于产生一种或多种异源蛋白质的用途的方法，所述植物细胞或植物包含修饰的糖基转移酶基因序列，其中一种或多种糖基转移酶的酶活性得到降低、抑制或基本上抑制。本专利技术还提供了植物或植物细胞，特征在于其具有的蛋白质中的N-聚糖基本上缺少以β_1，2-连接的木糖或以α-1，3-连接的岩藻糖，或二者。本专利技术还包含可得自本专利技术的植物或植物细胞的组合物，其包含一种或多种基本上缺少α -1, 3-连接的岩藻糖残基或 β -1, 2-连接的木糖残基或二者的异源蛋白质。本申请范围内使用的技术术语和表达一般是以植物生物学相关领域中通常对其应用的意义给出的。所有以下定义适用于本申请的全部内容。词语“包含”不排除其他成分或步骤，而不定冠词“一”或“一个”不排除复数形式。一个单一步骤可能满足权利要求提出的数种特征的功能。具体关系到一项属性或数值的术语“几乎”、“大约”、“约”等等分别精确地限定了所述属性或精确限定了所述值。在给定的数值化值或范围的上下文中，术语“大约”指的是给定值或范围的20%之内、10%之内或5%之内。如本专利技术内所用的，“植物”指的是处于生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其后代。如本专利技术内所使用的“植物细胞”指的是植物的结构及生理单位。植物细胞可能为以下形式没有细胞壁的原生质、分离的单个细胞或培养的细胞，或为更高级的组织单位的一部分，例如但不限于，植物组织、植物器官或整个植物。如本专利技术内使用的，“植物细胞培养物”包括植物细胞的培养物，例如但不限于，原生质、细胞培养物细胞、培养的植物组织中的细胞、外植体细胞及花粉培养物。如本专利技术内使用的，“植物材料”包括可获自植物的任何固态、液态或气态组合物， 或其组合，包括植物的叶、茎、根、花或花器部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、分泌物、提取物、细胞或组织培养物，或任何其他的部分或产物。如本文所使用的“植物组织”指的是组织形成结构或功能单位的一组植物细胞。植物群内的或培养的植物的任何组织都包括在内。这项术语包括但不限于整个植物、植物器官以及种子。如本文所使用的，“植物器官”涉及植物的可区分或已分化部分，如根、茎、叶、花芽或胚。·本文所使用的术语“多核苷酸”指的是核苷酸的多聚体，可以是未修饰或修饰的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。因此，多核苷酸可以为基因组DNA、互补DNA (cDNA)、mRNA或反义RNA，但不限于此。此外，多核苷酸可以为单链或双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、包含DNA和RNA的杂交份子、或者单链或双链区域混合的杂交分子。另外， 多核苷酸可由包含DNA、RNA或二者的三链区域组成。多核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.22 EP 10157243.61.遗传修饰的烟草植物细胞或包含所述修饰的植物细胞的烟草植物，其中修饰的植物细胞包含至少对在包含N-乙酰基-葡糖氨基转移酶的编码序列的基因组区域中的第一靶标核苷酸序列的修饰，这使得(i)修饰的植物细胞中的糖基转移酶的活性或表达相对于未修饰的植物细胞是降低的，且(ii)修饰的植物细胞中产生的蛋白质的N-聚糖上的α -1, 3-岩藻糖或β -1, 2-木糖或二者相对于未修饰的植物细胞是降低的。2.权利要求1的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其另外包含(a)至少对包含β (1，2)_木糖基转移酶的编码序列的基因组区域中的第二靶标核苷酸序列的修饰，或(b)至少对包含α (1，3)_岩藻糖基转移酶的编码序列的基因组区域中的第三靶标核苷酸序列的修饰，或(a)和(b)的组合。3.权利要求1的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其进一步包含在第一靶标核苷酸序列、第二靶标核苷酸序列、第三靶标核苷酸序列或任何两个或更多个前述靶标核苷酸序列的组合的等位基因变体中的修饰。4.前述权利要求中任何一项的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中第一靶标核苷酸序列为a.与选自SEQ ID N0:12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277、280 的核苷酸序列有至少70%、特别是至少80%、特别是至少90%的同一性；b.与选自SEQ ID N0:20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278、281的核苷酸序列有至少95%、特别是至少98%、特别是至少99%的同一性。5.根据权利要求2-4中任何一项的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中第二靶标核苷酸序列为a.与选自SEQID NO: 1、4、5、和17的核苷酸序列有至少70%、特别是至少80%、特别是至少90%的同一性;b.与选自SEQID N0:8和18的核苷酸序列有至少95%、特别是至少98%、特别是至少99%的同一性。6.根据权利要求2-5中任何一项的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中第三靶标核苷酸序列为a.与选自SEQID NO:27、32、37和47的核苷酸序列有至少70%、特别是至少80%、特别是至少90%的同一性；b.与选自SEQID NO:28、33、38和48的核苷酸序列有至少95%、特别是至少98%、特别是至少99%的同一性。7.根据前述权利要求中任何一项的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中植物为烟草栽培种PM132，其以登记号NCMB 41802保藏。8.根据前述权利要求中任何一项的修饰的烟草植物的后代，其中所述后代植物包含如前述权利要求中任何一项中所限定的修饰中的至少一种，其中糖基转移酶的活性或表达相对于未修饰的植物是降低的且Qi)修饰的植物中产生的蛋白质的N-聚糖上的α-1，3-岩藻糖或β -1, 2-木糖或二者相对于未修饰的植物细胞是降低的。9.用于产生异源蛋白质的方法，所述方法包括将包含编码异源蛋白质的核苷酸序列的表达构建物引入权利要求1-8中任何一项所限定的修饰的烟草植物细胞或植物中，所述异源蛋白质特别是疫苗抗原、细胞因子、激素、凝血蛋白质、载脂蛋白、用于人类替代疗法的酶、免疫球蛋白或其片段；以及培养包含所述表达构建体的修饰的植物细胞以产生异源蛋白质，以及可选地，由所述植物细胞再生植物并培养所述植物及其后代。10.核苷酸，其包含的核苷酸序列编码a.N-乙酰葡萄糖氨基转移酶或其片段，其核苷酸序列(i)选自SEQ ID 勵12、13、40、41、233、256、259、262、265、268、271、274、277 和 280;(ii)选自SEQ ID N0:20、21、212、213、219、220、223、227、229、234、257、260、263、266、269、272、275、278 和 281 ；(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列有至少95%、特别是至少98%、特别是至少99%的同一 I生；(iv)允许由或(iii)的核苷酸序列或其互补物组成的多核苷酸探针进行杂交，特别是在严格条件下；b.β (1，2)_木糖基转移酶或其片段，其核苷酸序列(i)选自SEQ ID N0:l、4、5、7 和 17 ；(ii)选自SEQ ID NO:8 和 18 ；(iii)与(i)或(ii)的核苷酸序列有至少95%、特别是至少98%、特别是至少99%的同一 I生；(iv)允许由或(iii)的核苷酸序列或其互补物组成的多核苷酸探针进行杂交，特别是在严格条件下；C. α (1，3)_岩藻糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·K·奥伊施，D·E·A·佛洛拉克，P·坎帕尼，C·M·波齐，J·卡蒂诺特，N·J·谢罗，N·V·伊万诺夫，
申请(专利权)人：菲利普莫里斯生产公司，
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