表达人源化CD3复合物的非人类动物制造技术

本发明专利技术提供了表达人源化CD3蛋白的非人动物。本发明专利技术还提供了经遗传修饰以在其基因组中包含人源化CD3蛋白的非人动物，例如啮齿动物。另外，本发明专利技术提供了制备此类非人动物的方法和组合物以及使用所述非人动物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达人源化CD3复合物的非人类动物相关申请的交叉引用本申请是2014年11月24日提交的62/083,653和2015年1月23日提交的62/106,999的正式(nonprovisional)申请，为所有目的，上述二者各自的全文以引用方式并入本文。序列表的引用本申请包含名为470382_SEQLST.txt的文本文件中的序列，该文件创建于2015年11月23日，大小为23,965字节，其以引用方式并入本文。
本专利技术提供了一种经遗传修饰的非人类动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，该动物基因组中包含编码人源化CD3蛋白(例如人源化CD3ε、人源化CD3δ和/或人源化CD3γ)的核酸序列。因此，本专利技术提供了表达人源化CD3复合物的经遗传修饰的非人类动物。本文还提供了一种临床前试验模型，用于CD3治疗剂，例如CD3抗体，例如CD3双特异性抗体。
技术介绍
除了T细胞受体亚基(例如高度可变的TCRα和TCRβ)，T细胞表面的T细胞受体复合物还包含不变的CD3ε、CD3δ和CD3γ链，这些链形成由CD3εδ和CD3εγ组成的异源二聚体。ζ链也与TCR/CD3复合物相关，其以二硫键连接的同源二聚体形式存在。CD3链在T细胞受体组装、转运到细胞表面、表面受体内吞作用、T细胞发育和T细胞信号转导方面具有重要作用。例如，对多种CD3亚基缺陷的研究证明，CD3链对于双阴性(CD4-CD8-，或DN)到双阳性(CD4+CD8+，或DP)到单阳性(CD4+或CD8+，或SP)T细胞转换非常重要。此外，CD3ε、CD3δ和CD3γ链各含有一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，而ζ链二聚体含有6个ITAM。这些基序起到信号转导模块的作用，并在TCR参与下被相关激酶磷酸化。抗CD3的抗体被证明能聚集T细胞上的CD3，从而通过与装载肽的MHC分子与TCR的结合相似的方式导致T细胞激活。因此，建议将抗CD3抗体用作旨在激活T细胞的候选治疗剂。此外，建议将能结合CD3和靶抗原的双特异性抗体用作治疗用途，涉及将T细胞免疫应答靶向到表达该靶抗原的组织和细胞。特别需要便利的动物模型，用于单特异性CD3和双特异性CD3治疗剂抗体的临床前试验。
技术实现思路
本文提供了经遗传修饰的非人类动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，该动物包含经遗传修饰、编码人CD3蛋白的细胞外结构域的内源性非人类CD3基因座，其中该人CD3蛋白是CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，或其任意组合。在一个实施例中，内源性非人类CD3基因座经遗传修饰，编码人CD3ε的细胞外结构域、人CD3δ的细胞外结构域和人CD3γ的细胞外结构域。在一个实施例中，内源性非人类CD3基因座经遗传修饰，以不表达相应非人类蛋白的功能性细胞外结构域。在一个实施例中，内源性非人类CD3基因座还编码相应内源性非人类动物CD3蛋白的跨膜结构域和细胞质结构域，其中该动物在其T细胞表面上表达嵌合CD3蛋白，该T细胞包括人CD3蛋白的细胞外结构域和内源性非人类动物CD3蛋白的跨膜结构域和细胞质结构域。在一个实施例中，非人类动物中编码人CD3的细胞外结构域的核酸序列被有效连接到编码相应非人类动物CD3蛋白的跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列。在一个具体实施例中，非人类动物包含：(a)在内源性CD3ε基因座处编码人CD3ε细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性非人类动物CD3ε跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接，(b)在内源性CD3δ基因座处编码人CD3δ细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性非人类动物CD3δ跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接，以及(c)在内源性CD3γ基因座处编码人CD3γ细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性非人类动物CD3γ跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接。其中非人类动物在其T细胞表面表达嵌合CD3ε、CD3δ和CD3γ。在一些实施例中，非人类动物中人CD3蛋白的细胞外结构域包括选自SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的序列。在一些实施例中，动物包括人CD3蛋白的细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的序列。在一些实施例中，本文所述的经遗传修饰的非人类动物包括与CD3启动子有效连接的编码人CD3蛋白细胞外结构域的核酸序列。因此，在一些实施例中，本文所述的非人类动物包括编码以下各项的核酸序列：与CD3启动子有效连接的人CD3ε的细胞外结构域，与CD3启动子有效连接的人CD3δ的细胞外结构域，以及与CD3启动子有效连接的人CD3γ的细胞外结构域。在一个实施例中，CD3启动子为非人动物CD3启动子。在一个实施例中，CD3启动子为人CD3启动子。在一个实施例中，CD3启动子为内源性非人CD3启动子。在一个具体实施例中，非人动物为哺乳动物。在一个实施例中，动物为啮齿动物。在一个实施例中，动物为大鼠或小鼠。在一个实施例中，动物为小鼠。因此，在一个实施例中，本文提供了一种经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含：(a)在内源性小鼠CD3ε基因座处编码人CD3ε细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性小鼠CD3ε跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接，(b)在内源性小鼠CD3δ基因座处编码人CD3δ细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性小鼠CD3δ跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接，以及(c)在内源性小鼠CD3γ基因座处编码人CD3γ细胞外结构域的核酸序列，该序列与编码内源性小鼠CD3γ跨膜结构域和细胞质结构域的核酸序列有效连接，并且所述小鼠在其T细胞表面表达人源化CD3ε、CD3δ和CD3γ。在一个实施例中，小鼠的人源化CD3ε蛋白的氨基酸序列如EQIDNO:24中所述，人源化CD3δ蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:25中所述，人源化CD3γ蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:26中所述。在一个实施例中，本文提供的经遗传修饰的小鼠包括与小鼠CD3启动子有效连接的编码人CD3细胞外结构域的核酸序列。在一个实施例中，启动子为内源性小鼠CD3启动子。在另一个实施例中，本文提供的经遗传修饰的小鼠包括与人CD3启动子有效连接的编码人CD3细胞外结构域的核酸序列。在一个实施例中，所述小鼠与未经遗传修饰以表达人源化CD3蛋白的小鼠相比，在胸腺中呈现相似的CD4+与CD8+细胞比率。在一个实施例中，所述小鼠胸腺中CD4+与CD8+细胞的比在未经遗传修饰以表达人源化CD3蛋白的小鼠的CD4+与CD8+细胞的比的30％、25％、20％、15％、12％、10％、5％或2％以内。在一个实施例中，所述小鼠与未经遗传修饰以表达人源化CD3蛋白的小鼠相比，在脾、淋巴结和外周血中呈现相似的T细胞和B细胞百分比。在一个实施例中，所述小鼠与未经遗传修饰以表达人源化CD3蛋白的小鼠相比，呈现相似数量的循环白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。因此，在一个方面，本文提供了一种经遗传修饰的小鼠，所述小鼠在内源性小鼠CD3基因座处包括编码人CD3蛋白细胞外结构域的核酸序列，其中所述人CD3蛋白选自CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，及其组合。在一个实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经遗传修饰的非人动物，所述经遗传修饰的非人动物包含经遗传修饰以编码人CD3蛋白的细胞外结构域的内源性非人CD3基因座，其中所述人CD3蛋白为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，或其任何组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.24 US 62/083,653;2015.01.23 US 62/106,9991.一种经遗传修饰的非人动物，所述经遗传修饰的非人动物包含经遗传修饰以编码人CD3蛋白的细胞外结构域的内源性非人CD3基因座，其中所述人CD3蛋白为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，或其任何组合。2.根据权利要求1所述的动物，其中所述内源性非人CD3基因座经遗传修饰以编码人CD3ε的细胞外结构域、人CD3δ的细胞外结构域以及人CD3γ的细胞外结构域。3.根据前述权利要求中任一项所述的动物，其中所述内源性非人CD3基因座经遗传修饰以不表达对应于所述人CD3蛋白的非人CD3蛋白的功能性细胞外结构域。4.根据权利要求1所述的动物，其中所述内源性基因座进一步编码所述内源性非人动物的CD3蛋白的跨膜结构域和胞质结构域，其中所述动物在其T细胞表面上表达嵌合的CD3蛋白，所述嵌合的CD3蛋白包含所述人CD3蛋白的所述细胞外结构域以及所述内源性非人动物CD3蛋白的所述跨膜结构域和胞质结构域。5.根据权利要求2所述的动物，其中所述动物包含：在内源性CD3ε基因座处编码人CD3ε的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码所述内源性非人动物的CD3ε的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；在内源性CD3δ基因座处编码人CD3δ的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码所述内源性非人动物的CD3δ蛋白的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；并且在内源性CD3γ基因座处编码人CD3γ的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码内源性非人动物CD3γ的CD3γ蛋白的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；其中所述非人动物在其T细胞表面上表达嵌合的CD3ε、CD3δ和CD3γ蛋白。6.根据前述权利要求中任一项所述的动物，其中所述动物包含人CD3蛋白的细胞外结构域，所述人CD3蛋白包含SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35的序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的动物，其中所述动物为哺乳动物。8.根据前述权利要求中任一项所述的动物，其中所述动物为啮齿动物。9.根据权利要求8所述的动物，其中所述动物为小鼠。10.根据权利要求9所述的小鼠，其中所述小鼠包含：在内源性小鼠CD3ε基因座处编码人CD3ε的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码内源性小鼠CD3ε的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；在内源性小鼠CD3δ基因座处编码人CD3δ的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码内源性小鼠CD3δ的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；并且在内源性小鼠CD3γ基因座处编码人CD3γ的细胞外结构域的核酸序列，所述核酸序列有效连接至编码内源性小鼠CD3γ的跨膜结构域和胞质结构域的核酸序列；并且其中所述小鼠在其T细胞表面上表达嵌合的CD3ε、CD3δ和CD3γ蛋白。11.根据权利要求10所述的小鼠，其中所述嵌合的CD3ε蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:24，所述嵌合的CD3δ蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:25，并且所述嵌合的CD3γ蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:26。12.根据前述权利要求中任一项所述的动物，所述动物对于经修饰的内源性非人CD3基因座而言为杂合的。13.根据权利要求1至11中任一项所述的动物，所述动物对于经修饰的内源性非人CD3基因座而言为纯合的。14.一种制备前述权利要求中任一项所述的经遗传修饰的非人动物的方法，包括：在内源性CD3基因座处将编码人CD3蛋白的细胞外结构域的核酸序列引入非人动物细胞的所述基因组中，其中所述人CD3蛋白为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，或其任何组合；由所述细胞繁殖所述经遗传修饰的非人动物。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞为单个ES细胞，并且所述单个ES细胞被引入小鼠胚胎中以繁殖小鼠。16.一种用于测试基于CD3的双特异性抗原结合蛋白的小鼠模型，其中所述抗原结合蛋白能够结合CD3和非小鼠目标抗原两者，所述小鼠模型包括经遗传修饰以编码人CD3蛋白的细胞外结构域的小鼠，其中所述人CD3蛋白为CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ，或其任何组合，并且包含表达或包含所述非小鼠目标抗原的细胞。17.根据权利要求16所述的小鼠模型，其中所述小鼠如前述权利要求中任一项所限定。18.一种筛选靶向目标抗原的候选药物的方法，包括：a.将所述目标抗原引入前述权利要求中任一项所述的经遗传修饰的小鼠中；b.使目标候选药物接触所述小鼠，其中所述候选药物针对所述人CD3和所述目标抗原；以及c.测定所述候选药物对预防、减少或消除通过所述目标抗原的存在或...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·L·奥尔森，E·史密斯，KM·V·莱，A·J·墨菲，G·瑟斯顿，D·郭，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US