【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及使用亲水相互作用液相色谱法(hilic)和质谱测定法确定病毒颗粒如腺相关病毒(aav)颗粒的异质性的方法。
技术介绍
1、基因疗法已成为遗传疾病的替代治疗。基因疗法涉及将一些遗传物质(dna、rna或寡核苷酸)转移到靶细胞中。实际上，目标基因(也称为转基因)必须通过携带dna或rna分子的载体递送至细胞。它是基于功能性基因的转移，以替代或补充缺陷型基因。转基因可通过载体递送至细胞中。递送方法根据治疗类型和待靶向的器官/组织而不同。
2、病毒颗粒已成为基因疗法和疾病治疗的载体。病毒载体，如基于腺相关病毒(aav)的基因组的那些病毒载体为基因递送提供了令人兴奋的平台。目前，已经描述了12种aav人血清型(aav1-12)，所述人血清型中的许多具有不同的细胞和组织嗜性，从而可能为从这一病毒属生成各种不同的载体类别提供了选择。
3、然而，在基因疗法中采用病毒载体面临的问题之一是病毒颗粒同质性的表征。尽管经典技术(如电子显微术和dna印迹)可表征病毒颗粒异质性(如aav异质性和聚集)，但在涉及产生临床级病毒载体制剂时，所述技术并未提供足够的分辨率来量化同质性。强烈推荐对组成性病毒衣壳蛋白(如aav载体的衣壳蛋白)的完整表征，包括它们的序列和翻译后修饰(ptm)，以确保产品质量和一致性。因此，需要用于确定病毒颗粒的同质性的方法。
技术实现思路
1、在一个方面，本专利技术提供了一种确定病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的化学计量的方法，其中所述方法包
2、在另一方面，本专利技术提供了一种确定病毒颗粒衣壳中的蛋白质的异质性的方法，其中所述方法包括：(a)对所述病毒颗粒进行hilic以分离所述病毒颗粒衣壳中的蛋白质组分；(b)测定所述蛋白质衣壳的蛋白质组分的质量；以及(c)将所述病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的测定质量与理论质量进行比较，其中所述病毒颗粒衣壳的蛋白质组分的一种或多种质量与所述理论质量的偏差指示衣壳异质性。
3、在一些实施方案中，所述病毒颗粒包括腺相关病毒(aav)颗粒。
4、在一些实施方案中，所述病毒衣壳的蛋白质组分包括所述aav颗粒的vp1、vp2和vp3。
5、在一些实施方案中，所述异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短的衣壳或修饰的衣壳中的一种或多种。
6、在一些实施方案中，所述aav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav4衣壳、aav5衣壳、aav6衣壳、aav7衣壳、aav8衣壳、aavrh8衣壳、aav9衣壳、aav10衣壳、aav11衣壳、aav 12衣壳或它们的变体。
7、在一些实施方案中，将vp1、vp2和vp3的质量与aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav4衣壳、aav5衣壳、aav6衣壳、aav7衣壳、aav8衣壳、aavrh8衣壳、aav9衣壳、aav10衣壳、aav11衣壳、aav 12衣壳或它们的变体中的一者或多者的理论质量进行比较。
8、在一些实施方案中，所述aav颗粒包含aav1反向末端重复序列(itr)、aav2 itr、aav3 itr、aav4 itr、aav5 itr、aav6 itr、aav7 itr、aav8 itr、aavrh8 itr、aav9 itr、aav10itr、aavrh10 itr、aav11 itr或aav 12itr。
9、在一些实施方案中，所述aav颗粒具有被选择用于转导受试者的肝脏细胞的衣壳血清型。
10、在一些实施方案中，所述aav颗粒是重组aav(raav)颗粒。
11、在一些实施方案中，所述aav颗粒包含编码异源转基因的aav载体。
12、在一些实施方案中，所述aav颗粒具有衣壳血清型aav7、aav8或aav9。
13、在一些实施方案中，所述aav颗粒具有衣壳血清型aav9。
14、在一些实施方案中，所述aav颗粒具有衣壳血清型aav9，并且是与抗cd63抗体连接的编码溶酶体α葡糖苷酶(gaa)的病毒载体。
15、在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含编码异源转基因的病毒载体。
16、在一些实施方案中，所述病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒科：腺病毒科、细小病毒科、逆转录病毒科、杆状病毒科和疱疹病毒科。
17、在一些实施方案中，所述病毒颗粒属于选自由以下组成的组的病毒属：富at腺病毒属(atadenovirus)、禽腺病毒属(aviadenovirus)、美洲白鲟腺病毒属(ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(siadenovirus)、双义浓核病毒属(ambidensovirus)、短浓核病毒属(brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(hepandensovirus)、重复浓核病毒属(iteradensovirus)、无脊椎对虾浓核病毒属(penstyldensovirus)、水貂阿留申细小病毒属(amdoparvovirus)、禽细小病毒属(aveparvovirus)、博卡细小病毒属(bocaparvovirus)、copiparvovirus、依赖细小病毒属(dependoparvovirus)、嗜红细胞细小病毒属(erythroparvovirus)、原细小病毒属(protoparvovirus)、tetraparvovirus、α逆转录病毒属(alpharetrovirus)、β逆转录病毒属(betaretrovirus)、δ逆转录病毒属(deltaretrovirus)、ε逆转录病毒属(epsilonretrovirus)、γ逆转录病毒属(gammaretrovirus)、慢病毒属(lentivirus)、泡沫病毒属(spumavirus)、α杆状病毒属(alphabaculovirus)、β杆状病毒属(betabaculovirus)、δ杆状病毒属(deltabaculovirus)、γ杆状病毒属(gammabaculovirus)、传喉炎病毒属(iltovirus)、马立克病毒属(mardivirus)、单纯疱疹病毒属(simplexvirus)、水痘病毒属(varicellovirus)、巨细胞病毒属(cytomegalovirus)、鼠巨细胞病毒属(muromegalovirus)、长鼻动物病毒属(proboscivirus)、玫瑰疱疹病毒属(roseolovirus)、淋巴滤泡病毒属(lymphocryptovirus)、玛卡病毒属(macavirus)、马疱疹病毒属本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种确定完整的未包膜的病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的异质性的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳蛋白质氨基酸取代、截短的衣壳蛋白质或修饰的衣壳蛋白质中的一种或多种。
3.一种表征完整的未包膜的病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的方法，所述方法包括：
4.如权利要求3所述的方法，其中所述HILIC的流动相包含三氟乙酸，并且其中在所述蛋白质组分的分离中使用脱溶剂气体。
5.如权利要求4所述的方法，其中通过包含丙酸和异丙醇的掺杂剂修饰所述脱溶剂气体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述丙酸和所述异丙醇的比例为3:1。
7.如权利要求3所述的方法，其中在加载至所述HILIC之前将所述病毒颗粒的所述样品与液体混合，其中所述液体包含所述HILIC的流动相的一种或多种组分。
8.如权利要求3所述的方法，其中通过多次注入将所述病毒颗粒的所述样品加载到所述HILIC。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述HILIC包括宽孔酰胺键合柱。
...【技术特征摘要】
1.一种确定完整的未包膜的病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的异质性的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳蛋白质氨基酸取代、截短的衣壳蛋白质或修饰的衣壳蛋白质中的一种或多种。
3.一种表征完整的未包膜的病毒颗粒的病毒衣壳的蛋白质组分的方法，所述方法包括：
4.如权利要求3所述的方法，其中所述hilic的流动相包含三氟乙酸，并且其中在所述蛋白质组分的分离中使用脱溶剂气体。
5.如权利要求4所述的方法，其中通过包含丙酸和异丙醇的掺杂剂修饰所述脱溶剂气体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述丙酸和所述异丙醇的比例为3:1。
7.如权利要求3所述的方法，其中在加载至所述hilic之前将所述病毒颗粒的所述样品与液体混合，其中所述液体包含所述hilic的流动相的一种或多种组分。
8.如权利要求3所述的方法，其中通过多次注入将所述病毒颗粒的所述样品加载到所述hilic。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述hilic包括宽孔酰胺键合柱。
10.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括测定基于所述hilic分离的所述蛋白质组分的相对丰度，从而确定所述病毒颗粒的所述病毒衣壳的所述蛋白质组分的化学计量。
11.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括将所述病毒衣壳的所述蛋白质组分的所述测定质量与理论质量进行比较，其中所述病毒衣壳的所述蛋白质组分的所述测定质量中的一种或多种质量与所述理论质量的偏差指示衣壳异质性。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述衣壳异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳蛋白质氨基酸取代、截短的衣壳蛋白质或修饰的衣壳蛋白质中的一种或多种。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述衣壳异质性是所述蛋白质组分的磷酸化、氧化或蛋白质主链剪切。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质组分是腺相关病毒(aav)颗粒的vp1、vp2或vp3。
15.如权利要求3所述的方法，其中所述病毒颗粒包含aav颗粒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述aav颗粒...
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