胃癌肺转移小鼠模型及其建立方法技术

本发明专利技术涉及胃癌肺转移小鼠模型及其建立方法，属于实验动物技术领域；本发明专利技术将BGC‑823和MKN‑45胃癌细胞在体外培养，细胞活力很旺盛的时候，用无菌的PBS重悬成适当的浓度；通过尾静脉接种于免疫缺陷的免疫缺陷型NUDE和SCID小鼠体内饲养后经过表面肺结节的统计、HE染色、IHC染色鉴定成功得到胃癌肺转移小鼠模型；本发明专利技术的小鼠模型简历所需要的实验条件和操作简便，实验后肺转移病灶明显，转移效率高，形成转移病灶后的小鼠存活周期适中；在转移结果的评价和统计上，由宏观上的肺结节计数改良为了微观上的IHC染色的阳性细胞计数，结果更加客观精准；该肿瘤转移的动物模型在科研和教学上可能将有广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
胃癌肺转移小鼠模型及其建立方法
本专利技术涉及胃癌肺转移小鼠模型及其建立方法，属于实验动物

技术介绍
胃癌（GastricCancer,GC）是全球第五大常见的恶性肿瘤（肺癌、肠癌、乳腺癌、肝癌）之一。在世界发达国家中，胃癌排列于癌症新发病数第五位，位于肺癌、乳腺癌、肠癌、肝癌之后；而在发展中国家列第二位，仅次于肺癌。国外文献统计，胃癌占消化系瘤50%，国内报道占62%。据统计，2012年有952000新病例（占所有癌症发病率7%）和723000例死亡病例（占所有癌症死亡率9%）。在我国，每年新确诊的胃癌有30万，死于胃癌者多达16万，占全部恶性肿瘤死亡人数的23%，占消化系肿瘤死亡人数的50%。我国胃癌死亡率20年（20世纪70年代至20世纪90年代）变化情况分析结果表明，胃癌死亡总体趋势是男性高于女性，农村高于城市；与世界各国相比，我国男性、女性胃癌世界死亡率居于首位。侵袭（或侵润）（invasion）与转移（metastases）是恶性肿瘤危害生命的最主要生物学特性。所谓肿瘤的侵袭实质是肿瘤细胞通过各种方式破坏周围正常组织结构，脱离原发肿瘤，异常地分布于周围组织及其间隙的过程，是恶性肿瘤发生远处转移的前提步骤。但部分良性肿瘤也有向周围组织及其间隙浸润的特性。对于没有发生侵袭或者侵袭程度较为局限的恶性肿瘤，通常以手术等治疗手段进行根治。转移是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的最主要特性之一。所谓转移是指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位。在体内通过各种转运途径，到达与原发部位不连续的组织继续增值生长，并形成与原发肿瘤同样病理性质的继发肿瘤的全过程。局部侵袭通过对局部正常组织器官的压迫、损毁，可抑制并影响正常组织器官的功能。而转移的出现，则标志着肿瘤发展的关键转折，远处转移一旦出现，往往意味着肿瘤进入晚期阶段，单凭局部治疗已难以达到治愈目的。转移的主要途经包括：1.血行转移；2.淋巴道转移；3.种植转移。胃癌的血道转移是个多步骤的过程，可概括为：癌细胞从原发灶脱离，入侵循环系统，穿越血管，粘附于血管壁，增殖生成继发肿瘤。胃癌的脏器转移中肺转移占20%~40%，仅次于肝转移。肿瘤细胞进入门静脉，经过肝脏在到达肺，形成转移灶；或胃周围经腹膜后转移淋巴结中的肿瘤细胞，上行经胸导管、静脉入血，形成肺转移；或肿瘤细胞经淋巴途径穿过膈肌，上行到纵膈，在肺门或纵膈形成淋巴结转移，进一步转移至肺。肿瘤细胞还可经膈肌直达胸膜，进而经肺门、纵膈波及肺，此种转移较少。动物实验作为人类疾病研究中的一个重要环节，能够较客观的模拟人类体内环境，这是体外实验完全不能替代的。随着物理学和化学的发展，动物模型学近年来取得了很大进展，各种人类疾病模型都被完美的复制，从而为人类的疾病研究提供了更广阔的平台。作为一个高侵袭性和致命性的恶性肿瘤，胃癌的侵袭性与抑癌基因、癌基因、生长因子及其受体等突变有关。对于肿瘤转移或复发的晚期患者，直到现在也很少有有效的治疗方案。因此，建立一种高效稳定的胃癌小鼠转移模型极为关键，传统的胃癌转移方法，多采用原位移植。需要预先制备好胃癌细胞株，或者寻找胃癌患者手术切除下来的癌组织注射到裸鼠的胃壁，构建了人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的方法，但是该模型存在潜伏期长，转移率低的问题。也有专业技术人员将胃癌组织块直接包埋于裸鼠的胃大弯处或者小弯处，虽然能稳定建立胃癌转移模型，但是手术风险较大，且术后对裸鼠的健康造成了一定的影响。也有一些先进的实验室，辅助显微外科设备，使得胃癌的原位移植对裸鼠的损伤降到最低。但由于实验条件要求较高，该方法也未能得到普及。也有的实验室试图通过皮下移植的方式，想要通过肌肉隔膜的转移，建立简单的胃癌转移模型。虽然移植的皮下肿瘤能侵润到肌肉层，但是很难穿透肌肉隔膜，且转移到肌肉表层的情况也很难准确统计。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，提供一种胃癌肺转移小鼠模型及其建立方法。本专利技术首先提供一种胃癌肺转移小鼠模型，所述小鼠为免疫缺陷型NUDE或SCID小鼠。本专利技术还提供一种胃癌肺转移小鼠模型的建立方法，所述方法具体操作如下：将BGC-823和MKN-45胃癌细胞在体外培养，细胞活力很旺盛的时候，用无菌的PBS重悬成适当的浓度；通过尾静脉接种于免疫缺陷的免疫缺陷型NUDE和SCID小鼠体内饲养后得到胃癌肺转移小鼠模型。所述BGC-823和MKN-45胃癌细胞体外培养于含10%胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中；。所述用PBS重悬成1x107个/mL细胞的浓度；所述胃癌细胞尾静脉接种量为200μL，即200x104个细胞/只。将尾椎接种BGC-823和MKN-45胃癌细胞的NUDE和SCID小鼠饲养观察数周，等到小鼠出现明显不良反应的时候，对小鼠进行猝死，并进行解剖；此时，会发现肺组织有明显的转移病灶；对小鼠的肺组织进行清洗，拍照，并用10%福尔马林固定，做成石蜡切片；进行HE和IHC染色，并对转移效率进行系统性的评估。本专利技术还提供一种肿瘤转移效率评估的方法，对所得到的胃癌肺转移小鼠进行解剖，取出已经有明显转移病灶的肺，制作石蜡切片，采用特异性的抗人类白细胞抗原的（内源性）抗体（Anti-HLAclassIABC）做IHC染色，随机选取组织切片三个相对分散的点，统计每一百个细胞中，阳性反应的细胞个数占比即为肿瘤转移效率。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果如下：与现有技术相比较，本专利技术在实验难度（不需要做手术原位移植），实验条件（不需要外科显微设备辅助），以及实验周期（不需要提前制备胃癌组织块或者等待胃癌患者进行手术）几方面，都得到了改进。且转移效率高，评估转移方法科学，非常适合用于科研和新药开发。本专利技术的模型建立成功之后，采用了多种评价机制，对肺转移后的结果做了评价。其中包括两种传统方式，即表面肺结节的统计和HE染色；其次，受免疫学启发，人源的细胞株转移到小鼠的肺部之后，采用了一种特异性的抗人类白细胞抗原的（内源性）抗体（Anti-HLAclassIABC）做IHC染色，在微观的条件下，来评价肺转移的效率。本专利技术从宏观肺结节到微观HE和IHC染色，都做到了定性和定量。系统的转移评价机制，将会为需要做胃癌细胞肿瘤转移模型的实验，提供更有说服力的精确证明。这也是本专利技术的一个重要环节，相较于传统的单一的计算肺表面结节的方式，主观因素将会更小，计数更加科学，评价更加客观准确。本专利技术通过筛选几种常用的胃癌细胞系：BGC-823，MKN-45，AGS和SGC-7901，最终确定BGC-823和MKN-45在两种常用的免疫缺陷型NUDE和SCID小鼠身上建立肿瘤肺转移模型。成模所需要的实验条件和操作较为简便，且实验后肺转移病灶明显，转移效率高，形成转移病灶后的小鼠，存活周期适中（1至1.5个月），很适合用于科研和教学。本专利技术形成转移病灶的部位是一个较大的组织器官（肺），相对于某些病灶转移到淋巴结或者腹膜的模型，转移病灶易于观察且易摘取。此外，还克服了传统胃癌小鼠转移模型的多种缺陷，实验的手术难度降低了，试验后（手术后）小鼠的存活率明显提高（基本可以达到100%），实验需要的设备（不需要体视显微镜）简单，实验需要的周期缩短（不需要提前制备组织块），以及后期评价转移效率的指标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤转移小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型为胃癌肺转移小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤转移小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型为胃癌肺转移小鼠模型。2.根据权利要求1所述的肿瘤转移小鼠模型，其特征在于，所述小鼠为免疫缺陷型NUDE或SCID小鼠。3.根据权利要求1所述的肿瘤转移小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型为胃癌细胞BGC-823接种NUDE小鼠、胃癌细胞BGC-823接种SCID小鼠、胃癌细胞MKN-45接种NUDE小鼠或胃癌细胞MKN-45接种SCID小鼠。4.如权利要求1所述的胃癌肺转移小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述方法具体操作如下：将胃癌细胞在体外培养，细胞活力很旺盛的时候，用无菌的PBS重悬成适当的浓度；通过尾静脉接种于免疫缺陷型小鼠体内饲养后；经过表面肺结节的统计、HE染色、IHC染色鉴定成功得到胃癌肺转移小鼠模型。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胃癌细胞为BGC-823和MKN-45；所述免疫缺陷型小鼠为NUDE和SCID小鼠。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晗青，鲁永金，屠志刚，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32