一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪制造技术

本发明专利技术公开了一种抗猪圆环病毒2型转基因猪。该抗猪圆环病毒2型转基因猪的抗猪圆环病毒2型siRNA基因序列整合在第10号染色体上，可以高效特异表达抗猪圆环病毒2型siRNA，来抑制猪圆环病毒2型的表达及生物活性，从而起到防治猪感染圆环病毒疾病的作用。同时，该转基因猪删除了外源标记基因，减少了外源基因对转基因猪个体健康的影响，同时也可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。

Transgenic pig resistant to porcine circovirus type 2

The invention discloses a porcine circovirus type 2 transgenic pig. The resistance against porcine circovirus type 2 porcine circovirus type 2 transgenic pig siRNA gene integrated in the chromosome tenth, can be highly specific expression of anti porcine circovirus type 2 siRNA, inhibits the expression and biological activity of porcine circovirus type 2, which contributes to the prevention and treatment of swine circovirus disease. At the same time, the transgenic pigs deleted exogenous marker genes, reduce the influence of exogenous genes on the transgenic pigs to individual health, but also can simplify the procedure of safety assessment of transgenic pigs, is conducive to the promotion of industrialization and application of the transgenic pigs.

【技术实现步骤摘要】
一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪
本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪。
技术介绍
在家畜动物的生长及疾病防治中，转基因技术日趋成熟，为便于转基因细胞系的筛选及转基因动物的检测，在转入目的基因的同时，常常同时转入外源标记基因，而EGFP绿色荧光蛋白可以在荧光显微镜下直接观察，而常常作为一种标记基因；Neo基因是一种抗生素抗性基因，细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏G418，而常常作为一种筛选标记基因用于转基因单克隆细胞的筛选。因而这两种基因无可避免的会出现在转基因动物中，而转基因动物成功获得后这些标记基因便不再需要了。同时，外源标记基因的存在将会对转基因家畜的健康将产生不良的影响，且我国转基因安全评价政策明文规定将标记基因等同于目的基因，同样必须经过复杂的安全评价，这无疑直接影响了转基因家畜的推广和产业化进程。因此，在进行转基因的操作中，通常在标记基因的两侧各加上一个相同的LoxP序列，以便在富集转基因成功的细胞后利用Cre/LoxP系统将转基因细胞内多余的标记基因删除。猪圆环病毒，属于圆环病毒科，为单股环状DNA病毒，分为1型和2型。其中猪圆环病毒1型(PCV1)不致病，猪圆环病毒2型(PCV2)具有致病性。在养猪业疾病防控中，疫苗是人们用来对付疾病的最常用手段。而由于圆环病毒灭活疫苗与亚单位疫苗成本高、注射次数多和容易造成机体应激等缺点，以及免疫效力有待提高，并不能大规模的免疫接种。另外，疫苗的使用在控制由PCV2感染而引起PMWS中获得了一些成功，但是这种综合征的发病病源是多样的，且在其他综合征上并没有突破，所以通过转基因手段引入抗PCV2siRNA基因序列，使用RNA干扰技术对猪圆环病毒2型的防御显得更有实际价值。在2013年12月25日公布的专利号为201310321355.6号，专利名称为“抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法”中公开了一种抗猪圆环病毒2型(PCV2)的表达载体和转基因猪及其构建方法，并通过该方法获得了F0代(原代)抗猪圆环病毒2型(PCV2)转基因猪，该转基因猪整合的外源基因包括目的基因抗PCV2siRNA的基因序列及标记基因Neo/EGFP融合表达基因序列，而标记基因的存在，将对该转基因猪产生不良的影响，并影响该转基因猪的安全评价，不利于该转基因猪的推广及产业化进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪，以解决上述问题。根据本专利技术的一个方面，提供了一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪，该转基因猪可以特异表达抗猪圆环病毒2型的siRNA。在一些实施方式中，该抗猪圆环病毒2型的转基因猪不包含外源标记基因，由此可以减少外源标记基因对于该转基因猪健康的影响，同时可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。在一些实施方式中，该抗猪圆环病毒2型转基因猪不包含Neo/EGFP融合表达外源标记基因，Neo基因是一种抗生素抗性基因，细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏G418，而常常作为一种筛选标记基因用于转基因单克隆细胞的筛选；而EGFP为绿色荧光蛋白表达基因与目的基因共同转染构建转基因单克隆细胞系时，便于用显微镜直观的观察筛选结果，对转基因动物也可以通过观察绿色荧光蛋白的表达来初步判断转基因的结果，但EGFP绿色荧光蛋白在细胞水平表达会对细胞产生一定的毒性，在转基因猪个体中也会对猪的健康产生一定的影响，因此删除了Neo/EGFP融合表达外源标记基因的转基因猪会减少对该转基因健康的影响，同时可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。在一些实施方式中，该抗猪圆环病毒2型siRNA的基因序列位于第10号染色体上，由此，该抗猪圆环病毒2型siRNA的表达量高，能更好的抑制猪圆环病毒2型基因的表达，起到防治猪感染圆环病毒2型疾病的作用。在一些实施方式中，该抗猪圆环病毒2型siRNA的基因序列位于第10号染色体上，且位于第10号染色体两个功能基因CUGBPElav-likefamilymember与trans-actingT-cell-specifictranscriptionfactorGATA-3之间，整合在该位点的抗猪圆环病毒2型siRNA的基因序列，具有较高的表达量及生物活性，能更好的抑制猪圆环病毒2型基因的表达，起到防治猪感染圆环病毒2型疾病的作用。在一些实施方式中，该抗猪圆环病毒2型转基因猪是通过如下步骤来实现的：(1)、抗猪圆环病毒2型表达载体的构建，该载体包含目的基因抗猪圆环病毒2型的siRNA表达基因序列，标记基因Neo/EGFP融合表达基因序列；(2)、将获得的抗猪圆环病毒2型的表达载体与转座酶质粒混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，通过体细胞克隆技术，并采用常规育种技术进行培育，即获得F0代抗猪圆环病毒2型的转基因猪；(4)、将获得的F0代抗猪圆环病毒2型的转基因猪与品种、遗传背景一致的野生型母猪杂交繁育获得能稳定遗传的抗猪圆环病毒2型的F1代转基因猪；(5)、对获得的F1代抗猪圆环病毒2型转基因猪基因检测，筛选F1代中抗猪圆环病毒2型siRNA表达量高，且只有一个外源基因插入位点的F1代转基因猪个体；(6)、将筛选出的F1代转基因猪个体进行外源基因整合位点分析；(7)、将筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并进行耳皮成纤维细胞系的建立；(8)、利用HTNCre重组酶处理F1代转基因猪的耳皮成纤维细胞系来删除Neo/EGFP标记基因，并进行细胞单克隆培养，筛选删除了Neo/EGFP标记基因的细胞单克隆；(9)、将筛选出的删除了标记基因的细胞单克隆作为体细胞克隆的核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，通过体细胞克隆技术，并采用常规育种技术进行培育，即获得F2代无Neo/EGFP标记基因的抗猪圆环病毒2型的转基因猪。在一些实施方式中，利用HTNCre重组酶处理F1代转基因猪的耳皮成纤维细胞系来删除Neo/EGFP标记基因的步骤如下：(1)、复苏F1代抗猪圆环病毒2型转基因猪耳皮成纤维细胞于细胞培养皿，长满后传代至6孔板，培养条件为37℃，5％CO2；(2)、待细胞密度达80％左右时，用DPBS洗2次，加入OPTI-MEM稀释的HTNCre，使其终浓度为200ng/μL，孵育3h后吸走HTNCre工作液，用DPBS洗2次，加入10％FBS的完全培养基继续培养；(3)、24h后，用0.25％的胰酶消化细胞，对细胞进行计数，按200个细胞/皿传至100mm细胞培养皿中，每隔3天换一次液并观察细胞单克隆的形成情况；(4)、当细胞培养至10天左右，细胞克隆团细胞数达到200个左右时，在倒置显微镜的观察下于细胞培养皿底部圈出细胞克隆团所在位置，并在克隆团外围再圈出无杂细胞的安全区域，同时用荧光显微镜观察细胞克隆团有无荧光，做好标记，以确保挑取更纯的无荧光细胞单克隆；(5)、吸走完全培养基，用DPBS洗2次，用镊子将克隆环小心准确放在已做标记的细胞克隆上，每个克隆环内加入两滴0.25％胰酶，在显微镜下观察至细胞变圆时，加入50μL左本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪可以特异表达抗猪圆环病毒2型的siRNA。

【技术特征摘要】
1.一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪可以特异表达抗猪圆环病毒2型的siRNA。2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪不包含外源标记基因。3.根据权利要求2所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的外源标记基因为Neo/EGFP融合表达基因。4.根据权利要求3所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型转基因猪的抗猪圆环病毒2型siRNA的基因序列整合在所述转基因猪的第10号染色体上。5.根据权利要求4所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型siRNA的基因序列位于第10号染色体两个功能基因CUGBPElav-likefamilymember与trans-actingT-cell-specifictranscriptionfactorGATA-3之间。6.根据权利要求1-5任一项所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪，其特征在于所述的抗猪圆环病毒2型转基因猪是通过如下步骤来实现的：(1)、构建抗猪圆环病毒2型表达载体，该载体包含目的基因抗猪圆环病毒2型的siRNA表达基因序列，标记基因Neo/EGFP融合表达基因序列；(2)、将获得的抗猪圆环病毒2型的表达载体与转座酶质粒混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，并筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，从而构建重构胚胎，并通过体细胞克隆技术和常规育种技术对胚胎进行培育，获得F0代抗猪圆环病毒2型的转基因猪；(4)、将获得的F0代抗猪圆环病毒2型的转基因猪与品种、遗传背景一致的野生型母猪杂交繁育获得能稳定遗传的F1代抗猪圆环病毒2型的转基因猪；(5)、对获得的F1代抗猪圆环病毒2型转基因猪进行检测，并筛选其中抗猪圆环病毒2型siRNA表达量高，且只有一个外源基因插入位点的F1代转基因猪个体；(6)、将筛选出的F1代转基因猪个体进行外源基因整合位点分析；(7)、将筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并建立耳皮成纤维细胞系；(8)、利用H...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珍芳，黄晓灵，李紫聪，刘德武，蔡更元，郑恩琴，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44