嵌合抗原受体制造技术

本文提供了与嵌合抗原受体(CAR)相关的方法和组合物，所述嵌合抗原受体具有来源于免疫球蛋白(Ig)的抗原结合结构域以及来源于T细胞受体(TCR)的恒定结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合抗原受体相关专利申请本申请要求2015年5月28日提交的临时申请No.62/167,650、2014年12月19日提交的临时申请No.62/094,603、2014年11月7日提交的临时申请No.62/076,836、2014年9月19日提交的临时申请No.62/052,947以及2014年9月19日提交的临时申请No.62/052,901的优先权权益，这些临时申请均据此全文以引用方式并入。序列表本申请包含以ASCII格式通过电子方式提交的序列表，该序列表据此以引用方式全文并入本文。2015年9月16日创建的所述ASCII副本被命名为RPB-010.25_SL.txt，其大小为42,074字节。
技术介绍
经遗传修饰的啮齿动物已被证明是对许多抗原具有特异性的治疗性抗体的重要来源，然而一些抗原已被证明难以靶向。因此，迫切需要一种新型治疗性抗原结合蛋白以及可用于生成此类抗原结合蛋白的方法和组合物。
技术实现思路
本文提供了与嵌合抗原受体(CAR)相关的方法和组合物。例如，本文提供了CAR和CAR多肽、表达CAR和CAR多肽的非人动物、编码CAR和CAR多肽的核酸、以及可用于制备和使用此类CAR、表达CAR的非人动物和编码CAR的核酸的组合物和方法。如本文所述，CAR是这样的抗原结合蛋白，其具有来源于免疫球蛋白(Ig)可变结构域的抗原结合结构域以及来源于T细胞受体(TCR)的恒定结构域。一般来讲，本文所提供的CAR包含两条CAR多肽链，其中一条多肽链包含TCRα恒定结构域，另一条多肽链包含TCRβ恒定结构域。每条多肽链包含Ig可变结构域，其中一条多肽链包含重链Ig可变结构域，另一条链包含Ig轻链(κ或λ)可变结构域。在一些实施例中，本文所提供的CAR对主要组织相容性复合体(MHC)蛋白(例如，I类MHC蛋白或II类MHC蛋白)所递呈的肽具有结合特异性。在某些方面，本文提供了表达CAR多肽的经遗传修饰的非人动物(例如，啮齿动物，如小鼠或大鼠)。在一些实施例中，非人动物的生殖系中包含CAR基因座，该CAR基因座包含具有非重排人Ig可变区基因区段(例如，非重排V、D和J重链基因区段、非重排Vκ和Jκ轻链基因区段或者非重排Vλ和Jλ轻链基因区段)的非重排可变区基因座以及TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因或TCRβ恒定区基因)。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，该CAR多肽包含由来源于非重排可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段为人Ig可变区基因区段。在一些实施例中，TCR恒定区基因为内源物种来源。在一些实施例中，TCR恒定结构域为人或啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。在一些实施例中，TCR恒定区基因为小鼠或大鼠TCR恒定区。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些方面，本文提供了表达CAR的经遗传修饰的非人动物(例如，啮齿动物，如小鼠或大鼠)。在一些实施例中，非人动物的生殖系中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有非重排人IgVH、DH和JH基因区段的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排IgVH、DH和JH基因区段有效连接至TCRβ恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，该第一CAR多肽链包含由来源于非重排IgVH、DH和JH基因区段的重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有Ig重链可变区基因(通用重链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座，其中经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，该第一CAR多肽链包含由重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人IgVκ和Jκ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排IgVκ和Jκ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由来源于非重排IgVκ和Jκ基因区段的重排Igκ可变区基因编码的Igκ可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人IgVλ和Jλ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排IgVλ和Jλ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由来源于非重排IgVλ和Jλ基因区段的重排Igλ可变区基因编码的Igλ可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有Ig轻链κ或λ可变区基因(通用轻链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由重排轻链可变区基因编码的Ig轻链可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定区。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达包含第一CAR多肽链和第二CAR多肽链的CAR。在一些实施例中，非重排可变区基因座中的一个或两个包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，一个或两个非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物表达CAR。在一些实施例中，CAR在非人动物的T细胞(例如，CD4和/或CD8T细胞)上表达。在一些实施例中，表达CAR的T细胞在经遗传修饰的非人动物的胸腺中经历了阳性和/或阴性选择。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体(即，在MHC蛋白的沟槽中递呈的肽)具有结合特异性。在一些实施例中，CAR对I类MHC蛋白所递呈的肽具有结合特异性。在一些实施例中，CAR对II类MHC蛋白所递呈的肽具有结合特异性。在本文所述经遗传修饰的非人动物的一些实施例中，CAR基因座位于内源TCR基因座(例如，内源TCRα基因座或内源TCRβ基因座)处。在一些实施例中，CAR基因座的TCR恒定区基因为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在其生殖系中包含嵌合抗原受体(CAR)基因座的经遗传修饰的非人动物，所述CAR基因座包含：具有非重排免疫球蛋白(Ig)可变区基因区段的非重排可变区基因座；以及具有T细胞受体(TCR)恒定区的恒定区基因座；其中人非重排Ig可变区基因区段有效连接至所述TCR恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，所述CAR多肽包含由来源于所述非重排Ig可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由所述TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.19 US 62/052,901;2014.09.19 US 62/052,947;1.一种在其生殖系中包含嵌合抗原受体(CAR)基因座的经遗传修饰的非人动物，所述CAR基因座包含：具有非重排免疫球蛋白(Ig)可变区基因区段的非重排可变区基因座；以及具有T细胞受体(TCR)恒定区的恒定区基因座；其中人非重排Ig可变区基因区段有效连接至所述TCR恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，所述CAR多肽包含由来源于所述非重排Ig可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由所述TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人源的。3.根据权利要求1或权利要求2所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为内源物种来源的。4.根据权利要求1或权利要求2所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为小鼠TCR恒定区基因或大鼠TCR恒定区基因。5.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig重链(IgH)可变区基因区段。6.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig轻链(IgL)可变区基因区段。7.根据权利要求6所述的经遗传修饰的非人动物，其中IgL可变区基因区段为人κ基因区段。8.根据权利要求6所述的经遗传修饰的非人动物，其中IgL可变区基因区段为λ基因区段。9.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为TCRα恒定区基因。10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRα链。11.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR基因座位于内源TCRα基因座处。12.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。13.根据权利要求11所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。14.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为TCRβ恒定区基因。15.根据权利要求14所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRβ链。16.根据权利要求14所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。17.根据权利要求16所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。18.根据权利要求16所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。19.一种在其生殖系中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座的经遗传修饰的非人动物，所述第一CAR基因座包含具有非重排免疫球蛋白(Ig)VH、DH和JH基因区段的第一非重排可变区基因座以及具有T细胞受体β(TCRβ)恒定区基因的第一恒定区基因座，其中所述非重排IgVH、DH和JH基因区段有效连接至所述TCRβ恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，所述第一CAR多肽链包含由来源于所述非重排IgVH、DH和JH基因区段的重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由所述TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域，并且所述第二CAR基因座包含具有非重排IgVκ和Jκ基因区段的第二非重排可变区基因座以及具有T细胞受体α(TCRα)恒定区基因的第二恒定区基因座，其中所述非重排IgVκ和Jκ基因区段有效连接至所述TCRα恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，所述第二CAR多肽链包含由来源于所述非重排IgVκ和Jκ基因区段的重排Igκ可变区基因编码的Igκ可变结构域以及由所述TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域，其中所述经遗传修饰的非人动物表达包含所述第一CAR多肽链和所述第二CAR多肽链的CAR。20.根据权利要求19所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述IgVH、DH和JH基因区段和/或所述IgVκ和Jκ基因区段为人源的。21.根据权利要求19或20所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因和/或所述TCRα恒定区基因为内源物种来源的。22.根据权利要求19或20所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因和/或所述TCRα恒定区基因为小鼠基因或大鼠基因。23.根据权利要求19至22中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRα链和/或功能性TCRβ链。24.根据权利要求19至23中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述第二CAR基因座位于内源TCRα基因座处。25.根据权利要求24所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排IgVκ和Jκ基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。26.根据权利要求24或25所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。27.根据权利要求19至26中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述第一CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。28.根据权利要求27中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排IgVH、DH和JH基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。29.根据权利要求27或28所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。30.根据权利要求1至29中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCI类α链多肽。31.根据权利要求30所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述一种或多种嵌合I类α链多肽选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和HLA-L。32.根据权利要求1至31中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达人β-2-微球蛋白多肽。33.根据权利要求1至32中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCII类α链多肽，和/或一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCII类β链多肽。34.根据权利要求33所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述一种或多种嵌合MHCII类α链多肽选自HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和HLA-DRA，并且/或者所述一种或多种嵌合MHCII类β链多肽选自HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和HLA-DRB。35.根据权利要求1至34中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8α链多肽，和/或包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8β链多肽。36.根据权利要求1至35中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达嵌合CD4多肽，所述嵌合CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域和细胞质结构域。37.根据权利要求1至36中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。38.根据权利要求1至37中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR在所述经遗传修饰的非人动物的T细胞上表达。39.根据权利要求38所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述T细胞在所述经遗传修饰的非人动物的胸腺中经历阳性和阴性选择。40.根据权利要求1至39中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物为啮齿动物。41.根据权利要求40所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述啮齿动物为小鼠。42.一种制备表达对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR的T细胞的方法，包括：(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；以及(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞。43.一种根据权利要求42所述的方法制备的T细胞。44.一种制备表达对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR的T细胞杂交瘤的方法，包括：(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞；以及(c)由步骤(b)的所述T细胞制备T细胞杂交瘤。45.一种根据权利要求44所述的方法制备的T细胞杂交瘤。46.一种用于制备编码对在MHC上递呈的肽具有特异性的Ig可变结构域的核酸的方法，包括：(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞；以及(c)从所述T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸。47.一种根据权利要求46所述的方法制备的、编码对在MHC上递呈的肽具有特异性的Ig可变结构域的核酸。48.一种用于制备对在MHC上递呈的肽具有特异性的抗体的方法，包括：(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞；(c)从所述T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸；(d)将编码所述Ig可变结构域的所述核酸与Ig恒定结构域在宿主细胞中有效连接；以及(e)在使得所述宿主细胞表达包含所述Ig可变结构域和所述Ig恒定结构域的抗体的条件下培养所述宿主细胞。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述Ig恒定结构域为人Ig恒定结构域。50.一种根据权利要求48或49所述的方法制备的、对在MHC上递呈的肽具有特异性的抗体。51.一种用于制备表达包含人Ig可变结构域和人TCR恒定结构域的CAR的人细胞的方法，包括：(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的非人动物T细胞；(c)从所述非人动物T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸；以及(d)将编码所述Ig可变结构域的所述核酸与编码人TCR恒定结构域的核酸在人细胞中有效连接，使得所述人细胞表达包含所述Ig可变结构域和所述人TCR恒定结构域的CAR。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述人细胞为人T细胞。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述人T细胞为离体分离的人T细胞。54.一种根据权利要求51至53中任一项所述的方法制备的、表达包含人Ig可变结构域和人TCR恒定结构域的CAR的人细胞。55.一种从根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的、表达CAR的细胞。56.根据权利要求55所述的细胞，其中所述细胞为T细胞。57.根据权利要求55所述的细胞，其中所述细胞为T细胞杂交瘤。58.一种从根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的、包含重排Ig可变区基因的核酸。59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述核酸编码CAR。60.一种从根据权利要求55...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·瑟斯顿，A·J·莫菲，L·麦克唐纳，J·麦克韦尔特尔，N·屠，C·古尔，V·沃伦妮娜，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US