检测治疗性外来体的方法技术

本申请涉及一种检测治疗性外来体的方法，所述方法包括检测外来体的活性。所述活性可以选自以下组：(a)免疫调节活性；(b)补体抑制活性；(c)蛋白酶体活性；(d)糖酵解酶活性；(e)抗氧化活性；(f)细胞外基质(ECM)修饰活性；(g)NT5E(CD73)外生‑5’‑外核苷酸酶活性；(h)离子稳态活性；以及(i)分子伴侣活性。如果所述外来体被检测到具有一种或多种这些活性，所述外来体可能包括具有治疗活性的治疗性外来体。

【技术实现步骤摘要】
检测治疗性外来体的方法本申请是申请号为201280017773.X，申请日为2012年2月10日，专利技术名称为“检测治疗性外来体的方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本专利技术涉及医学领域。
技术介绍
外来体一度被认为是细胞的“垃圾袋”，用来丢弃不需要的蛋白质1。然而，外来体越来越多地被认为具有重要的生理功能，尤其是在细胞通讯中。外来体是许多细胞类型都有分泌的50-100ηm的双脂质膜泡2。它们属于一类叫做微粒的分泌的细胞产物，其广泛囊括了所有分泌的膜泡。除了外来体，微粒还包括微泡(100-1000ηm)、核外粒体(50-200ηm)、膜颗粒(50-80ηm)、外来体状囊泡(20-50ηm)和凋亡囊泡(50-500ηm)。这些不同类别的微粒的主要区别参数是它们的大小，其中有最明确定义的类别是外来体。外来体在蔗糖中的密度为1.10至1.19克/毫升，在100,000g沉淀，具有富含胆固醇的脂质膜，其含有鞘磷脂、神经酰胺、脂筏和暴露的磷脂酰丝氨酸。外来体的生物合成是一个复杂的过程，涉及到通过生物合成和内吞途径的复杂的细胞内膜运输和物质分拣(cargosorting)。证实这种复杂生物合成的证据就是外来体的明显特征是拥有内质网和核内体的标识，例如Alix、Tsg101、Rab蛋白等等。外来体在通过多泡体(MVBs)与质膜融合而释放之前存储在多泡体内。外来体被发现调节细胞间通讯，特别是在免疫或肿细胞中3-8。最近，当本专利技术人公布了人ESC起源的MSC的外来体把心肌缺血再灌注(MI/R)受伤小鼠模型中的梗死面积减少约50％时，延伸此项功能到包括组织修复9，10。这些外来体是使用HPLC上的尺寸排阻而纯化为直径约50-100ηm均匀大小的微粒，它们同时携带蛋白质和RNA载荷9,11,12。然而，MSC外来体的这种心脏保护作用的机制尚不确定。一部分原因可能是由于本专利技术人缺乏对外来体的一般生物效能的理解。尽管进行了大量针对来自各种细胞类型和生物液体的外来体的蛋白质组学和RNA概况的分析，外来体的蛋白质和RNA的生物效能在很大程度上仍然未被调查。截至目前，大多数生物效能的研究还局限在免疫细胞对外来体所作出的免疫反应上，特别是树突细胞2，但这些生物反应的分子或生化基础还没有被阐明。
技术实现思路
为了解决这个缺陷，本专利技术人对HPLC纯化的外来体进行了全面的蛋白组学分析来首先确定存在于这些外来体中的蛋白，然后使用这些蛋白质来预测外来体内生物活性或潜能的类型。这继而通过生化或细胞测定而得以证实。总共检测到了866个独特的基因产物，它们可以根据功能分成32个过度代表的生物过程，这表明外来体有潜力发挥广谱的生物化学或细胞作用。为了评估这种潜力，本专利技术人选择了这些蛋白，对于这些蛋白，可以评估其生化和/或细胞活动的测定是可以获得的且该测定的总和可以证实外来体广谱的生物化学和细胞潜力，并提供对MSC外来体的心脏保护性质的候选分子机理。这里考察的蛋白质包括分解葡萄糖以生成ATP和NADH的糖酵解酶，增加糖酵解的PFKB3，水解AMP为能够通过腺苷受体激活信号级联的腺苷的CD73，抑制膜攻击复合物(MAC)形成的CD59，和蛋白酶体20S。根据本专利技术的第一方面，本专利技术人提供了一种用于检测治疗性外来体的方法。该方法可以包括检测外来体活性。该方法可以包括免疫调节活性。它可以包括补体抑制活性。它可以包括蛋白酶体活性。它可以包括糖酵解酶活性。它可以包括抗氧化活性。它可以包括细胞外基质(ECM)修饰活性。它可以包括NT5E(CD73)外生-5'-外核苷酸酶活性。它可能包括离子稳态活性。它可以包括分子伴侣活性。它可包括上述的任何一个或多个活性。活性可以包括免疫调节活性。免疫调节活性可以通过检测表D10中列出的蛋白质的活性来检测。活性可以包括补体抑制活性。补体抑制活性可以通过检测表D1中列出的蛋白质的活性来检测。该活性可以包括蛋白酶体活性。蛋白酶体活性可以通过检测表D2中列出的一个或多个，优选全部蛋白质的活性来检测。该活性可以包括糖酵解酶活性。糖酵解酶活性可以通过检测表D3中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。该活性可以包括抗氧化活性。抗氧化活性可以通过检测表D4中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。该活性可以包括细胞外基质(ECM)修饰活性。细胞外基质(ECM)修饰活性可以通过检测表D5中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。该活性可以包括NT5E(CD73)外生-5'-外核苷酸酶活性。NT5E(CD73)外生-5'-外核苷酸酶活性可以通过检测表D6中列出的一个或多个，优选全部，蛋白质的活性来检测。该活性可以包括离子稳态活性。离子稳态活性可以通过检测表D7中列出的一种或多种，优选全部，蛋白质来检测。该活性可以包括分子伴侣活性。分子伴侣活性可以通过检测表D8中列出的一种或多种，优选全部，蛋白质来检测。该活性可以包括免疫调节活性。免疫调节活性可以通过检测表D10中列出的一种或多种，优选全部，蛋白质来检测。如果一项活性被检测到，外来体可能能够抑制补体介导的细胞裂解。它也可以可替代的或可附加的，能够减少梗死面积，例如在心肌缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型中检测到的，或其能够降低氧化应激，例如在过氧化氢(H2O2)诱导的细胞死亡的体外试验中测定到的。它可以是上述两个活动。如果一项活动被检测到，外来体有可能包括一个具有治疗活性的治疗性外来体。该治疗活性可以包括保护心脏的活性。该治疗活性治疗一个或多个疾病，其选自心力衰竭、骨髓疾病、皮肤疾病、烧伤和退行性疾病如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、癌症、心肌梗死、皮肤创伤、皮肤失调、皮肤病变、皮炎、银屑病、湿疣、寻常疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮肤癌、异位性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽肿病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、特征是最初的损伤诱导导致炎症和免疫失调导致慢性组织重组的病理状况，包括纤维化和功能丧失，肾缺血性损伤，囊性纤维化，鼻窦炎和鼻炎或者骨科疾病。本专利技术的第二方面提供一种方法，其包括以下步骤：(a)从间充质干细胞条件培养物(MSC-CM)中分离外来体，任选地，包括从其他组分中基于分子量、尺寸、形状、组成或生物活性分离外来体，以及(b)检测所分离的外来体中上述活性，优选通过检测上述一种或多种蛋白质的活性。本专利技术的第三方面提供生产外来体的方法，所述方法包括：(a)获得间充质干细胞条件培养物(MSC-CM)；(b)浓缩间充质干细胞条件培养物，例如用超过1000kDa的膜进行超滤；(c)将浓缩的间充质干细胞条件培养物进行体积排阻色谱，如使用TSKGuard柱SWXL，6×40mm，或TSK凝胶G4000SWXL，7.8x300mm柱；(d)选择UV吸收的部分，例如，在220nm处，表现出动态光散射，如由准弹性光散射(QELS)检测出的；其中，步骤(d)举例包括通过保留时间为11-13分钟，如12分钟来洗脱收集组分；并且检测外来体中上文所述的活性，优选通过检测一种或多种上文所述的蛋白质的活性。本专利技术的第四方面提供一种检测外来体是否含有治疗活性的方法，该方法包括检测如上所述的酶活性，其中，如果检测到酶活性，那么外来体包含治疗活性。本专利技术的实施，除另有说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定间充质干细胞外来体是否包含治疗活性的方法，所述方法包括检测外来体中的或外来体的NT5E(CD73)外生‑5'‑外核苷酸酶活性。

【技术特征摘要】
2011.02.11 SG 201100995-81.一种测定间充质干细胞外来体是否包含治疗活性的方法，所述方法包括检测外来体中的或外来体的NT5E(CD73)外生-5'-外核苷酸酶活性。2.根据权利要求1的方法，其中NT5E(CD73)外生-5’-外核苷酸酶活性通过检测表D6中所列的一个或多个，优选所有的蛋白的活性进行检测。3.根据权利要求1或2的方法，其中NT5E(CD73)外生-5’-外核苷酸酶活性通过检测外来体中的或外来体的磷酸化的AKT、磷酸化的AKT1、磷酸化的AKT2、磷酸化的AKT3、磷酸化的ERK1或磷酸化的ERK2(或其任意组合)而进行检测。4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中NT5E(CD73)外生-5’-外核苷酸酶活性通过检测选自下述的蛋白的活性而进行检测：外生-5’-外核苷酸酶(GenBank登录号X55740.1,CAA39271.1)、外生-腺苷三磷酸双磷酸酶(GenBank登录号S73813.1,AAB32152.1)、AKT1,磷酸化形式(GenBank登录号NM_001014432,NP_001014431)、AKT2,磷酸化形式(GenBank登录号NM_001626,NP_001617)、AKT3,磷酸化形式(GenBank登录号NM_005465,NP_005456)、ERK1,磷酸化形式(GenBank登录号NM_001040056,NP_001035145)和ERK2,磷酸化形式(GenBank登录号NM_002745,NP_002736)。5.根据前述任一项权利要求的方法，其中外来体由人类胚胎干细胞起源的间充质干细胞生产。6.根据前述任一项权利要求的方法，其中，如果一个活性被检测到，所述外来体可能能够：(i)抑制补体介导的细胞裂解；或...

【专利技术属性】
技术研发人员：林赛娟，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG