一种烟草HKT1基因及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种烟草HKT1基因，序列如Seq ID No.1所示，所述HKT1基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物；提取烟草细胞总RNA；合成烟草细胞cDNA；以烟草细胞cDNA为模板进行HKT1基因的PCR扩增得到目的片段，测序后得到HKT1基因序列。所述的HKT1基因全长1488bp，经功能验证，本发明专利技术所述的HKT1基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母具有钾离子吸收和转运功能，烟草植株中超量表达HKT1基因可促进烟草对钾离子的吸收，本发明专利技术所述的HKT1基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。

Tobacco HKT1 gene, preparation method and application thereof

The invention provides a tobacco HKT1 gene sequence of Seq ID No.1 shows, the preparation method of the HKT1 gene, which comprises the following steps: primer design PCR; extraction of tobacco cell total RNA; synthesis of tobacco cDNA cells; cDNA cells with tobacco as the template for the HKT1 gene fragment was amplified by PCR the HKT1 gene sequence obtained after sequencing. The HKT1 gene is 1488bp, the functional verification of HKT1 gene of the invention into potassium uptake deficient yeast mutant R5421 after recombinant yeast with potassium ion absorption and transport function of HKT1 gene can promote the absorption of tobacco potassium overexpressing tobacco plants, HKT1 gene of the invention has promote potassium absorption and transport function.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草HKT1基因及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种烟草HKT1基因及其制备方法和应用。
技术介绍
钾离子通道是允许钾离子特异通透质膜的离子通道，而阻碍其他离子通透-特别是钠离子。这些通道一般由两部分组成：一部分是通道区，选择并允许钾离子通过，而阻碍钠离子；另一部分是门控开关，根据环境中的信号而开关通道。高亲和性K+转运蛋白HKT(High-affinityK+Transporter)属于膜转运蛋白家族，其主要功能是介导K+和Na+的共转运或仅介导Na+的转运。目前已经从许多植物(小麦，拟南芥，水稻等)中克隆到这个基因(Schachtmanetal1994；邵群，2006；)；植物HKT1可以分成两种类型，一种是高亲和K转运体(Horieetal2001)，一种是Na+选择性的的转运体(Uozumietal2000)。烟草是一种耗钾量很大的作物，烟叶钾含量是衡量烟叶品质的的重要指标，目前，对于烟草中钾离子通道的研究较少，烟草HKT1的功能未知。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供烟草HKT1基因及其制备方法和应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种烟草HKT1基因，所述HKT1基因的序列如SeqIDNo.1所示。本专利技术提供了上述技术方案所述HKT1基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述的反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’；提取烟草细胞总RNA；合成烟草细胞的cDNA；以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKT1基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKT1基因序列。优选的，所述PCR扩增引物的设计是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述XM_009601690.1的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。优选的，所述的PCR扩增的体系为20μL体系，包括PremixExTaq10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA1μL，ddH2O8μL。优选的，所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。优选的，所述的目的片段在测序之前还包括，将所述目的片段导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进行测序。优选的，所述菌落PCR验证使用的正向引物核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，菌落PCR验证使用的反向引物核苷酸序列为：5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’。优选的，所述菌落PCR验证的体系为10μL，包括PremixExTaq5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH2O4μL。本专利技术还提供了一种烟草HKT1基因在促进烟草植株钾离子吸收和转运方面的应用。优选的，将所述的烟草HKT1基因转入到烟草植株中，使HKT1基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的HKT1基因，是通过同源克隆的方法制备获得的，所述的HKT1基因全长1488bp，经功能验证，本专利技术提供的HKT1基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母具有钾离子吸收，转运功能。本专利技术实施例中，3个HKT1基因转基因烟草叶中钾离子的质量含量分别是1.6％，1.2％，1.9％，非转基因的烟草叶中钾离子的质量含量是0.84％，转基因的烟草叶中钾离子的含量显著高于非转基因的，可见，烟草植株中超量表达HKT1基因可促进烟草对钾离子的吸收。因此，本专利技术提供的HKT1基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。附图说明图1为实施例2中HKT1基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母在钾离子浓度为0mM和2mM的培养基上的生长情况；其中图1A为钾离子浓度为0mM的培养基上的生长情况，图1B为钾离子浓度为2mM的培养基上的生长情况；图中，1为转入HKT1基因的重组酵母，2为阴性对照P416，3为阳性对照；从左到右依次为原液、10倍稀释液、100倍稀释液在培养基上的生长结果。具体实施方式本专利技术提供了一种烟草HKT1基因，所述烟草钾离子通道基因的序列如SeqIDNo.1所示，本专利技术中所述的HKT1基因全长1488bp。本专利技术提供了上述技术方案所述烟草HKT1基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物；提取烟草细胞总RNA；合成烟草细胞cDNA；以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKT1基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKT1基因序列。本专利技术中，所述的PCR扩增引物的设计，是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述XM_009601690.1的序列如SeqIDNo.2所示。在本专利技术中，所述的PCR扩增引物优选包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，长度为20bp；所述反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’，长度为19bp。本专利技术在进行HKT1基因的PCR扩增之前，提取烟草细胞总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。在本专利技术中，所述的烟草细胞总RNA的提取采用本领域常用的提取细胞总RNA的技术方案即可，本专利技术的实施例中具体的可采用Trizol法。在本专利技术中，所述的烟草细胞总RNA提取的原料为烟草的新鲜叶片，所述烟草采用为本领域常规的烟草品种，本专利技术实施例中，所述烟草品种为K326。本专利技术在提取得到烟草细胞总RNA后，将所述烟草细胞总RNA反转录合成cDNA。本专利技术中，所述的cDNA的合成，采用本领域常规的cDNA的合成方法即可，无其他特殊要求；具体的本专利技术实施例中采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒完成cDNA的合成。本专利技术在得到cDNA之后，进行HKT1基因PCR扩增，得到目的片段。在本专利技术中，所述HKT1基因PCR扩增的体系优选为20μL体系，包括PremixExTaq10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA1μL，ddH2O8μL。在本专利技术中，所述HKT1基因的PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。本专利技术在HKT1基因PCR扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到HKT1基因。本专利技术在所述的PCR扩增后优选的对目的片段进行纯化，本专利技术对所述纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。本专利技术在所述纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进行测序。本专利技术在得到阳性克隆后，优选的采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆。在本专利技术中，所述菌落PCR的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草HKT1基因，其特征在于，所述HKT1基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草HKT1基因，其特征在于，所述HKT1基因的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。2.权利要求1所述的烟草HKT1基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述的反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’；提取烟草细胞总RNA；合成烟草细胞cDNA；以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKT1基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKT1基因。3.根据权利要求2所述的烟草HKT1基因的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增引物的设计是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述XM_009601690.1的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。4.根据权利要求2所述的烟草HKT1基因的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增的体系为20μL体系，包括PremixExTaq10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA1μL，ddH2O8μL。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：任学良，鲁黎明，李立芹，郭玉双，张洁，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州,52