一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，涉及一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法。一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，该方法以赖诺普利氢化物为底物原料，加入合适体积的水，在脂肪酶存在的条件下发生选择性酯水解(R,S)‑赖诺普利氢化物，保留(S,S)‑赖诺普利氢化物；反应完全后，将混合液分离，获得(S,S)‑赖诺普利氢化物。本发明专利技术具有催化效率高、立体选择性好、酶与底物易于分离且酶可重复使用、成本低、环境污染小等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法
本专利技术属于生物催化
，涉及一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法。
技术介绍
赖诺普利(Lisinopril)，化学名称为N-{N-[(S)-1-羧基-3-苯丙基]-L-赖氨酰}-L-脯氨酸，是依那普利拉的赖氨酸衍生物，1987年由默克公司研发上市的第三代血管紧张素Ⅱ转换酶抑制剂(angiotensin-convertingenzymeinhibitor，ACEI)，主要用于治疗高血压，抑制ACE以减少血管紧张素I(AngI)向血管紧张素II(AngII)的转化，导致AngII浓度降低，从而使AngII的升压作用及醛固酮分泌作用下降。还有降低左心室重量指数(LVMI)、改善左心室功能、降低急性心肌梗死患者死亡率，以及显著降低尿白蛋白排泌率等作用。赖诺普利氢化物是合成赖诺普利工艺中的关键手性中间体，其有2个手性位点，分为(R,S)-型和(S,S)-型，合成赖诺普利后续反应所需的构型为(S,S)-型。本专利技术选用的赖诺普利氢化物为混合物，其(S,S)-型∶(R,S)-型含量比为2～3:1，二者的结构式如下。随着医药技术的不断发展，人们对手性药物安全性的认识逐渐深入，手性药物的市场不断扩大，世界医药领域对手性药物的开发正形成一股潮流。不对称合成和拆分技术的研究已经成为焦点，其中化学合成手性药物是利用手性源、手性助剂、手性催化剂以及各种中间体等，通过不对称合成得到手性药物。尽管化学合成方法日趋成熟，但是手性药物种类多样、更新迅速，化学合成的应用有一定的局限性，并且化学合成方法造成的环境问题不容忽视。因此，利用生物系统的多样性和安全性来获得光学纯药物已成为另一选择，特别是一些微生物产生酯酶/脂肪酶用于生产手性药物的单一对映体是化学合成之外的重要途径，已经越来越受到人们关注。目前关于赖诺普利的合成路线主要是以3-苯甲酰丙烯酸乙酯为起始原料，与三氟乙酰赖氨酸在氢氧化锂的作用下，发生不对称加成反应，再经Pd/C氢化还原、环合、缩合、水解等反应过程制备得到，此工艺通过不对称加成反应选择性较低，(S,S)-型∶(R,S)-型含量比通常为75：25。为目前工业生产上采用的主要方法。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，不同于传统化学拆分法，获得光学纯度较高的(S,S)-赖诺普利氢化物，且将细胞固定化后减少产物中菌体自身降解产生的杂质，且易于分离。为达到上述的专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，该方法以赖诺普利氢化物为底物原料，加入合适体积的水，在脂肪酶存在的条件下发生选择性酯水解(R,S)-赖诺普利氢化物，保留(S,S)-赖诺普利氢化物；反应完全后，将混合液分离，获得(S,S)-赖诺普利氢化物；所述脂肪酶采用通过不动杆菌(Acinetobactersp.)Cxzy-L119产生的胞内脂肪酶，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏编号：CCTCCNO：M2016572。作为优选，所述反应时间为4～36h、反应温度为35～38℃，反应pH维持在7.0～7.3。作为再优选，反应过程用15％Na2CO3(V/V)溶液进行调节pH。作为优选，所述赖诺普利氢化物在反应体系浓度10～80g/L，优选为40～60g/L。作为优选，按体积比向反应液中加入1:0.1～0.2的助溶剂。作为在优选，所述助溶剂选自甲醇、乙腈中的任一种。作为优选，所述脂肪酶以固定化细胞重量计，所述固定化细胞量为5～40g/L，再优选为5～25g/L。作为优选，反应结束后，将上述反应液真空抽滤，保留固定化细胞以便重复使用，再将抽滤后得到的反应液35～60℃旋蒸除去助溶剂和水解副产物乙醇，调节pH为7.2～7.8，按体积比向反应液中加入1:0.7～1.5的乙酸乙酯，30～50℃保温并搅拌2～4h，萃取1～3次，分层后保留有机相，将有机相合并，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得固体浓缩物，(S,S)-赖诺普利氢化物。作为再优选，固定化细胞可重复利用次数不低于15次。作为优选，所述的脂肪酶采用通过不动杆菌(Acinetobactersp.)Cxzy-L119产生的胞内脂肪酶，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏编号：CCTCCNO：M2016572。采用硅藻土吸附结合聚乙烯亚胺和戊二醛交联法固定化不动杆菌(Acinetobactersp.)Cxzy-L119细胞。作为再优选，所述脂肪酶制备方法为：(1)将不动杆菌Acinetobactersp.Cxzy-L119接种至LB培养基，30℃培养1～2天，获得斜面菌体；所述斜面培养基浓度组成为：NaCl10g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，pH调节7.0，121℃灭菌20min；(2)将斜面菌体接种至种子培养基，30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基浓度组成为：NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，K2HPO41.0g/L，NH4NO31.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，橄榄油2.0g/L，121℃灭菌20min；(3)将种子液以体积浓度1％～10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体；所述发酵培养基浓度组成：NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，K2HPO41.0g/L，NH4NO31.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，赖诺普利氢化物2g/L，115℃灭菌20min。当然，本专利技术的脂肪酶也可以选用市售的脂肪酶，优选为胞内脂肪酶；市售的脂肪酶如AmanoPROTINAPConc，LipaseAYS"Amano"等。当在转化效率和转化率不及不动杆菌Acinetobactersp.Cxzy-L119菌体细胞。本专利技术还公开了不动杆菌(Acinetobactersp.)Cxzy-L119菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏编号：CCTCCNO：M2016572。本专利技术还公开了上述的不动杆菌Cxzy-L119菌株生产的胞内脂肪酶。包括上述的胞内脂肪酶的反应催化剂载体，其该反应催化剂载体采用硅藻土吸附结合聚乙烯亚胺和戊二醛交联法固定化所述的不动杆菌Cxzy-L119菌株细胞。本专利技术以脂肪酶为催化剂，在一定条件下进行立体选择性酯水解(R,S)-赖诺普利氢化物，保留底物为(S,S)-赖诺普利氢化物，生物酶催化反应通常具有以下优点：(1)高度立体专一性；(2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单；(3)反应条件较温和；(4)酶蛋白无毒，易降解，环境污染少，适于规模生产。进一步，将酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，更有利于自动化生产。再进一步，本专利技术以固定化后的不动杆菌Acinetobactersp.Cxzy-L119菌体细胞为催化剂，底物转化率达到31.2％，(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：该方法以赖诺普利氢化物为底物原料，加入合适体积的水，在脂肪酶存在的条件下发生选择性酯水解(R,S)‑赖诺普利氢化物，保留(S,S)‑赖诺普利氢化物；反应完全后，将混合液分离，获得(S,S)‑赖诺普利氢化物；所述脂肪酶采用通过不动杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：该方法以赖诺普利氢化物为底物原料，加入合适体积的水，在脂肪酶存在的条件下发生选择性酯水解(R,S)-赖诺普利氢化物，保留(S,S)-赖诺普利氢化物；反应完全后，将混合液分离，获得(S,S)-赖诺普利氢化物；所述脂肪酶采用通过不动杆菌（Acinetobactersp.）Cxzy-L119产生的胞内脂肪酶，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2016年10月17日，保藏编号：CCTCCNO：M2016572。2.根据权利要求1所述的一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：所述反应时间为4~36h、反应温度为35~38℃，反应pH维持在7.0~7.3；优选，反应过程用15%Na2CO3(V/V)溶液进行调节pH。3.根据权利要求1所述的一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：所述赖诺普利氢化物在反应体系浓度10~80g/L，优选为40~60g/L。4.根据权利要求1所述的一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：按体积比向反应液中加入1:0.1~0.2的助溶剂；优选，所述助溶剂选自甲醇、乙腈中的任一种。5.根据权利要求1所述的一种生物催化拆分赖诺普利氢化物的方法，其特征在于：所述脂肪酶以固定化细胞重量计，所述固定化细胞量为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利坤，肖延铭，钱敏帆，杨卫华，谈聪，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33