利用腈水解酶工程菌制备R‑邻氯扁桃酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种利用腈水解酶工程菌制备R‑邻氯扁桃酸的方法，包括：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以邻氯扁桃腈为底物，以缓冲液为反应介质进行转化反应，反应结束后，对反应产物混合液进行分离纯化，获得R‑邻氯扁桃酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌是由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。该方法反应速率非常快，反应转化率也很高。

【技术实现步骤摘要】
利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法。
技术介绍
(R)-(-)-邻氯扁桃酸是一种具有广泛用途的医药中间体和精细化工品，主要用于抗血小板凝集药物氯吡格雷的合成。氯吡格雷作为全球重磅级药物，2010年全球销售额近100亿美元，2011和2012年的销售额也都在90亿美元以上。随着2012年5月17号氯吡格雷专利到期，全球掀起了一股仿制热潮。而作为其重要中间体的(R)-(-)-邻氯扁桃酸随之也水涨船高，国内外需求不断增长，因此研究如何获得高浓度、高纯度的(R)-(-)-邻氯扁桃酸将具有重要的市场意义。国内外通过腈水解酶酶法制备(R)-(-)-邻氯扁桃酸已有报道，但数量不多。张陈胜通过传统的基因组探矿技术从Stappiaaggregata中筛选到对邻氯扁桃腈具有对映体选择性的腈水解酶LaN，产物(R)-(-)-邻氯扁桃酸的ee值为96.5％，但活力不高。BASF公司构建了来源于A.faecalisATCC8750的腈水解酶Y296位的不同突变体，其中Y296A突变体对外消旋的邻氯扁桃腈的相对比活力为Y296野生型的近10倍。Y296C突变体对所检测的每一个取代的扁桃腈都具有相当高的活力，而对于未发生取代的扁桃腈活力则没有改变。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，以解决上述问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，包括：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以邻氯扁桃腈为底物，以缓冲液为反应介质进行转化反应，反应结束后，对反应产物混合液进行分离纯化，获得R-邻氯扁桃酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌是由SEQIDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。本专利技术以源于BradyrhizobiumjaponicumUSDA110的腈水解酶(bll6402，NP_773042)氨基酸序列为模板进行改造，获得的新型重组腈水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术可推动腈水解酶在手性医药中间体合成中的应用，极大降低R-邻氯扁桃酸的生产成本，进而降低氯吡格雷的价格，具有很好的示范作用，将会产生良好的社会效益与经济效益。而通过生物催化法的温和反应条件将显著降低能耗及三废排放量。项目的顺利实施不仅可以实现R-邻氯扁桃酸的绿色生产，还可以为建立以腈水解酶为基础的生物催化法制备手性药物中间体等手性化合物的技术平台提供技术支撑，能够提高我国的生物、化工、医药等领域的手性药物、手性食品添加剂和手性农药及其中间体等的研发水平，有利于我国的绿色生产、工业生物技术的发展，有着广阔的应用前景，对国民经济的可持续发展具有重要意义。工程菌可选自大肠杆菌，优选的，所述工程菌为M15大肠杆菌菌株。转染所述工程菌的质粒可以选自pQE30。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述底物初始浓度为80～120mM，所述湿菌体的质量终浓度为10～30mg/mL。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述缓冲液为80～120mMpH7.5～8.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述缓冲液中添加体积百分数为8％～12％的乙醇作为助溶剂。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸的反应采用连续流加补料的反应模式；更优选的，按1L计，补料时所用的发酵补料培养基的组份包括：酵母膏40～80g、蛋白胨60～100g以及甘油450～550ml。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工程菌以体积浓度0.3～0.7％的接种量接种至含终浓度0.03～0.07mM卡那霉素和0.8～1.2mM氨苄青霉素的LB液体培养基中，发酵培养至培养液的OD600为0.5～0.7，向培养液中加入终浓度为0.8～1.2mM的IPTG，诱导培养14～18小时后离心收集菌体得到所述催化剂。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述发酵培养的培养温度为36～38℃，所述诱导培养的培养温度为28～32℃。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述发酵培养阶段，溶氧量控制在20％～30％。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，按1L计，所述LB液体培养基的组份包括：酵母膏10～14g、蛋白胨12～20g、甘油3～8ml、K2HPO420～28g、KH2PO43～4g以及MgSO41.5～2.5g。优选的，如上所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，所述对反应产物混合液进行分离纯化的方法为结晶法，具体包括：经过离心处理后的反应产物混合液，通过浓HCl进行酸化至pH0.8～1.2，通过旋转蒸发浓缩至1/6～1/2体积，在8～12℃条件下冷却结晶，收集晶体，重复浓缩结晶过程1～3次后，将收集到的晶体溶于乙醇中进行重结晶。与现有技术相比，本专利技术可在12h反应时间里，共将600mM的底物完全水解，由于底物流加和pH调控的稀释作用，累计产生了112g/L的产物邻氯扁桃酸。整个反应过程中反应转化率保持在90％以上。反应10h后停止流加，继续反应2h后底物全部转化完。反应速率非常快，反应转化率也很高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为发酵过程中OD600的增长情况；图2为发酵过程中DCW的增长情况；图3为发酵过程中酶产量的增长情况；图4为连续流加反应制备R-邻氯扁桃酸进程结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。1.1新型腈水解酶的基因挖掘1.1.1序列筛选以源于BradyrhizobiumjaponicumUSDA110的腈水解酶(bll6402，NP_773042)氨基酸序列为模板，通过BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)程序搜索潜在的扁桃腈腈水解酶。我们设立了三个标准对BLASTP的结果进行筛选。首先氨基酸序列一致性高于90％或者低于30％的都被剔除掉，将与bll6402具有高度相同性和不同性的酶过滤掉。具有相同序列一致性的酶只保留一到两个。第二个标准是序列的来源。来源于同一种属的序列只保留一个。因为他们往往具有非常高的序列一致性和相同的酶学特性。来源于同一菌株的所有不同序列全部本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用腈水解酶工程菌制备R‑邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，包括：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以邻氯扁桃腈为底物，以缓冲液为反应介质进行转化反应，反应结束后，对反应产物混合液进行分离纯化，获得R‑邻氯扁桃酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌是由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，包括：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以邻氯扁桃腈为底物，以缓冲液为反应介质进行转化反应，反应结束后，对反应产物混合液进行分离纯化，获得R-邻氯扁桃酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌是由SEQIDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成。2.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述底物初始浓度为80～120mM，所述湿菌体的质量终浓度为10～30mg/mL。3.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述缓冲液为80～120mMpH7.5～8.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液。4.根据权利要求3所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述缓冲液中添加体积百分数为8％～12％的乙醇作为助溶剂。5.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸的反应采用连续流加补料的反应模式；优选的，按1L计，补料时所用的发酵补料培养基的组份包括：酵母膏40～80g、蛋白胨60～100g以及甘油450～550ml。6.根据权利要求1所述的利用腈水解酶工程菌制备R-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：许向阳，何秋霞，楚杰，刘可春，宋在伟，韩利文，
申请(专利权)人：枣庄市杰诺生物酶有限公司，山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37