本发明专利技术涉及酶催化动态动力学拆分1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的方法。更具体的，本发明专利技术提供了一种利用环己胺氧化酶及其突变体将1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉消旋体动态动力学拆分为单一构型产物（S）-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的方法，所述的（S）-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉是合成中枢性镇咳药右美沙芬的关键中间体。本方法具有收率高、立体选择性好、反应条件温和等显著特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种镇咳药关键中间体制备的新方法，具体涉及酶催化动态动力学拆分制备氢溴酸右美沙芬关键中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的新方法。
技术介绍
氢溴酸右美沙芬又叫氢溴酸右甲吗喃，化学名为(+)-3-甲氧基-17-甲基-（9α,13α,14α）-吗啡喃氢溴酸一水合物，适用于感冒、急性或慢性支气管炎、支气管哮喘、咽喉炎、肺结核以及其它上呼吸道感染引起的干咳。氢溴酸右美沙芬的合成方法很多，如中国专利CN201310041846、CN201310051880，CN201210405684、CN201310004262、CN201410169133以及文献[今日药学，2008,18(4)，63-64]、[Helv.Chim.Acta1956,39,1376?1386]，大部分制备方法均需要使用中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉。传统制备该中间体的方法是通过对消旋的1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉进行手性拆分获得的，如中国专利CN201210073513、美国专利US8148527及文献[Helv.Chim.Acta1956,39,1376?1386]。该方法不仅收率较低、操作繁琐，而且产生大量的废水。也有报道用金属不对称催化还原1-(4-甲氧基苄基)-3,4,5,6,7,8-六氢异喹啉制备(S)-1-(4-甲氧<br>基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的方法，如中国专利CN201410169133及文献[Tetrahedron:Asymmetry1998,9,4043–4054]。我们发现目前存在的工艺中，尚没有利用酶催化动态动力学拆分1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的方法。本专利技术拟采用环己胺氧化酶及其突变体结合非选择性还原剂实现1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的动态动力学拆分，该过程具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氢溴酸右美沙芬关键中间体(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的制备新方法。本专利技术的
技术实现思路
为：酶催化动态动力学拆分1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉制备(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，其特征在于：（1）环己胺氧化酶及其突变体的表达测序成功的重组菌株划线于LB（含100μg/mL氨苄青霉素）的平板上，37°C温箱培养12-14h后菌落生长到足够大。挑取单菌落，接种于5mL选择性LB（含100μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。次日将培养过夜的菌液再接种到500mL（1:50）选择性LB（含100μg/mL氨苄青霉素）液体培养基中37℃，200rpm/min振荡培养至OD600=0.6-0.8时。加入1mol/LIPTG于菌液中，使IPTG终浓度为0.5mM，25℃，200rpm/min振荡培养10h。诱导表达后的菌体以6000rpm离心5min，收集菌体后以10：1的比例（10mL菌液中的菌体加入1mL缓冲液）pH6.5的DEAEBindingbuffer。菌体重悬后使用高压均质机破碎菌体，具体程序是400Mp破碎一遍800Mp破碎两遍，然后以14000rpm高速离心30min，取上清，用0.45滤膜过滤。采用AKTApurifier10进行蛋白纯化，DEAE-FF柱首先用100%DEAEElutionbuffer洗脱液冲洗柱子出去杂质，再用DEAEBindingbuffer进行平衡。平衡后开始上样，过滤后的上清以1mL/min上样到DEAE-FF柱中，用Bindingbuffer以2mL/min的流速冲洗直到280nm紫外吸收线走平。用50%的Elutionbuffer梯度洗脱未结合的杂蛋白，然后采用线性洗脱的方法30min时间内，Elutionbuffer浓度由50%上升到80%。以2mL/管的体积分管收集Elutionbuffer浓度上升过程中出现的洗脱峰，收集黄颜色的洗脱蛋白并SDS-page检测纯化效果。（2）1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的动态动力学拆分酶催化动态动力学拆分1-(4-甲氧苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉采用如下反应体系：1-(4-甲氧苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉、酶和还原剂，反应一段时间后。液相色谱监测反应进程至反应结束，经后处理得到产物，通过液相色谱检测与标准品比对检测产物ee值，并通过测定产物比旋光度确定产构型。化学方程式1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的动态动力学拆分本专利技术所述的环己胺氧化酶可以是其突变体，也可以是氨基酸序列同源性大于80%的其它单胺氧化酶。本专利技术所述的酶可以是基因工程菌、破菌液、纯酶或固定化酶活细胞。本专利技术所述的还原剂可以是硼胺、硼氢化钠、硼氢化钾及其它能使亚胺还原的还原剂。附图说明图1(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉及其消旋体的HPLC图；图2(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的1HNMR；图3(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的13CNMR。具体实施方式以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解
技术实现思路
，但是这些实施例不构成对本专利技术的限制。实施例1：1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的动态动力学拆分1-(4-甲氧苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉(100mg),突变体Y321I破菌上清50mL（表达离心后取8g湿菌体溶解于100mM,pH6.5的磷酸缓冲液中高压破碎后12000×g离心30min取上清）和硼铵(80mg)，反应在25℃，200rpm的摇床中进行。液相色谱监测反应进程，32h后反应结束，用5M的氢氧化钠调节pH到10然后用二氯甲烷萃取三次（50mL×3）。萃取液浓缩到25mL再与25mL1M的盐酸溶液混合。分离获得的水相用5M的氢氧化钠调节pH到10然后用二氯甲烷萃取三次（25mL×3）。有机提取物经过无水硫酸钠干燥后，旋干得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶催化动态动力学拆分制备氢溴酸右美沙芬关键中间体(S)‑1‑(4‑甲氧基苄基)‑1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8‑八氢异喹啉的新方法，其特征在于利用环己胺氧化酶及其突变体结合还原剂实现1‑(4‑甲氧基苄基)‑1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8‑八氢异喹啉的动态动力学拆分制备(S)‑1‑(4‑甲氧基苄基)‑1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8‑八氢异喹啉，包括如下步骤：a）环己胺氧化酶及其突变体的表达；b）环己胺氧化酶及其突变体催化1‑(4‑甲氧基苄基)‑1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8‑八氢异喹啉的动态动力学拆分。
【技术特征摘要】
1.一种酶催化动态动力学拆分制备氢溴酸右美沙芬关键中间体(S)-1-(4-甲氧基苄
基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的新方法，其特征在于利用环己胺氧化酶及其
突变体结合还原剂实现1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉的动态
动力学拆分制备(S)-1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢异喹啉，包括如下
步骤：
a）环己胺氧化酶及其突变体的表达；
b）环己胺氧化酶及其突变体催化1-(4-甲氧基苄基)-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢
异...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚培圆，李广悦，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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