本发明专利技术公开了一种微生物不对称氧化制备S‑奥美拉唑的方法，具体的是用黑曲霉不对称氧化硫醚制备高对映体纯S‑奥美拉唑。该方法采用固定化黑曲霉细胞在水‑有机溶剂两相体系中催化奥美拉唑硫醚不对称氧化，反应产率高，对映体过量率高（e.e.≥99.5%）。本发明专利技术的优点是反应立体选择高，反应条件温和，避免了现有技术中化学催化剂、手性辅助试剂的使用，环境友好，安全性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制药工程领域，特别涉及一种微生物不对称氧化法制备高对映体纯S-奥美拉唑的方法。
技术介绍
质子泵抑制剂奥美拉唑、 兰索拉唑、雷贝拉唑等都含有亚砜活性基团。在奥美拉唑的两个对映异构体中, S 构型具有更高的药理活性和安全性, 生物利用度也更高。因此，单一对映体纯手性质子泵抑制剂的高效合成引起了人们的极大兴趣。这类化合物的单一对映体可通过手性拆分、手性辅助试剂诱导、手性试剂转化和不对称催化合成等化学方法和生物催化方法合成。手性拆分法原料利用率低，最大理论产率为50%，而不对称催化合成由于其原子经济性和绿色化学特征，成为今后发展的必然趋势。化学不对称氧化硫醚合成亚砜主要是利用金属和有机小分子为催化剂，已取得了重大的进展，如中国专利CN 102241670 B、CN 103130772 B、CN 104447692 A、CN 105503673 A等报道了手性络合物催化剂催化的手性亚砜的合成方法。但这类方法往往存在过度氧化、手性催化剂昂贵，副产物多、反应条件苛刻等缺点。利用微生物细胞或酶作催化剂合成手性亚砜可有效解决上述问题。尽管离体酶催化效率高，但也存在酶稳定性差,分离纯化过程较烦琐,成本较高等问题；另外,反应过程中必须额外添加昂贵的辅酶。全细胞催化避免了酶的分离,酶稳定性高,无需外加昂贵的辅因子。与传统的化学法相比，生物催化法反应条件温和，避免极端温度和压力等化学反应条件，具有高度的化学、区域和立体选择性，高效性及良好的环境相容性和安全性。正是由于生物催化的这些优势，利用生物法合成手性亚砜受到了越来越多的关注。世界专利 WO1996017076 和 WO1996017077 分别公开了利用微生物选择性氧化潜手性硫醚和外消旋砜类化合物选择性还原拆分的方法制备奥美拉唑单一对映体，但是微生物稳定性差，产物提纯困难，后续处理繁琐，产率较低。中国专利CN 103114109 B报道了红球菌用于催化硫醚合成S-苯甲亚砜的方法，e.e. >99.9%，但底物仅限于苯甲硫醚、苄基苯硫醚、苄基对甲基苯硫醚、苄基对甲氧基苯硫醚或苄基对硝基苯硫醚，不能催化奥美拉唑硫醚的不对称转化。同时该方法在缓冲液中进行硫醚的不对称催化反应，存在底物溶解度低和非天然底物硫醚对细胞毒性的问题。
技术实现思路
本专利技术经过大量实验筛选，从马棒状杆菌、土地戈登氏菌、红球菌、灰霉菌、黑曲霉、米曲霉等众多微生物菌种的不同菌株中，筛选出一株黑曲霉菌株，ATCC 9029，发现其可将奥美拉唑硫醚不成转化成S-奥美拉唑，且R-奥美拉唑和砜产物几乎不生成。其他的微生物菌种虽然也可催化硫醚的氧化，但有的主要生成R-型亚砜，且少量的产物砜生成，如马棒状杆菌，红球菌 IEGM 66可将奥美拉唑硫醚不成转化成S-奥美拉唑，但e.e.值（<90%）远不能满足手性药物的对映体纯度要求。本专利技术采用固定化黑曲霉 ATCC 9029细胞在水-有机溶剂两相体系中催化奥美拉唑硫醚不对称氧化，反应产率高，对映体过量率高（e.e.≥99.5%）。实现了S-奥美拉唑的高效合成。本专利技术的优点是反应立体选择高，反应条件温和，避免了现有技术中化学催化剂、手性辅助试剂的使用，环境友好，安全性好。本专利技术所述的一种微生物不对称氧化制备高对映体纯S-奥美拉唑的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）将黑曲霉 ATCC 9029制成孢子浓度为1×105–1×106孢子/mL的孢子悬浮液，并接种到如下组成的培养基中(w/v)：1.0-3.0%蛋白胨, 0.5-1.5%酵母浸膏, 0.05-0.15% NaNO3, 0.05-0.15% KH2PO4, 0.01-0.1% MgSO4•7H2O，初始pH6.0，接种量0.8-2.0%，32-35℃培养72-76小时，用过滤式离心机离心得到湿细胞；（2）将步骤（1）中的湿细胞制备成黑曲霉 ATCC 9029固定化细胞，所用的固定化方法，为目前常用的固定化方法；（3）用步骤（2）的固定化细胞催化底物奥美拉唑硫醚（Ⅱ）不对称氧化合成S-奥美拉唑（Ⅰ），反应介质为水-有机溶剂两相体系，反应式如下：将pH8.5-8.9的Tris-HCl缓冲液，与含有底物奥美拉唑硫醚的有机溶剂混合，形成水-有机溶剂两相反应体系，水相与有机相的体积比为1:1-3:1，反应体系中奥美拉唑硫醚浓度为80-150g/L，加入固定化细胞，使固定化细胞的浓度为2×104-1.2×105U/L，开始生物催化氧化反应，反应温度33-35℃，反应时间为60-70小时，反应结束后滤出固定化细胞，反应液用乙酸乙酯萃取后离心,有机相用无水Na2SO4干燥,蒸出乙酸乙酯，得到产物S-奥美拉唑，产率为96-98％，对映体过量率e.e.值为99.5-99.9%。具体实施方式实施例1（1）将黑曲霉 ATCC 9029制成孢子浓度为1×105孢子/mL的孢子悬浮液，并接种到如下组成的培养基中(w/v)：1.0%蛋白胨, 0.5%酵母浸膏, 0.05% NaNO3, 0.05% KH2PO4, 0.01% MgSO4·7H2O，初始pH6.0，接种量0.8%，在1000L发酵罐中，32℃培养72小时，用过滤式离心机离心得到湿细胞；（2）将步骤（1）所得的湿细胞加入到浓度（w/v）为2.0%的海藻酸钠的水溶液中，搅拌均匀，制成海藻酸钠-细胞悬浮液，缓慢滴加至0.2mol/L的CaCl2溶液中，搅拌作用下形成固定化小球，在CaCl2溶液继续浸泡硬化1-2h,过滤出固定化小球，用生理盐水洗涤数次即得黑曲霉 ATCC 9029固定化细胞；（3）用步骤（2）的固定化细胞催化底物奥美拉唑硫醚（Ⅱ）不对称氧化合成S-奥美拉唑（Ⅰ），反应在1000L底部通气搅拌反应器中进行，反应介质为水-有机溶剂两相体系，有机相为甲苯，将pH8.5的Tris-HCl缓冲液，与含有底物奥美拉唑硫醚的甲苯混合，形成水-有机溶剂两相反应体系，水相与有机相的体积比为2:1，反应体系中奥美拉唑硫醚浓度为80g/L，加入固定化细胞，使固定化细胞的浓度为2×104U/L，开始生物催化氧化反应，反应温度33℃，反应时间为60小时，反应结束后滤出固定化细胞，反应液用乙酸乙酯萃取后离心,有机相用无水Na2SO4干燥, 蒸出乙酸乙酯，得到产物S-奥美拉唑，产率为97％，对映体过量率e.e.值为99.6%。实施例2（1）将黑曲霉 ATCC 9029制成孢子浓度为5×105孢子/mL的孢子悬浮液，并接种到如下组成的培养基中(w/v)：3.0%蛋白胨, 1.5%酵母浸膏, 0.15% NaNO3, 0.15% KH2PO4, 0.1% MgSO4·7H2O，初始pH6.0，接种量1.5%，在2000L发酵罐中，33℃培养74小时，用过滤式离心机离心得到湿细胞；（2）黑曲霉 ATCC 9029固定化细胞制备方法同实施例1；（3）用步骤（2）的固定化细胞催化底物奥美拉唑硫醚（Ⅱ）不对称氧化合成S-奥美拉唑（Ⅰ），反应在2000L底部通气搅拌反应器中进行，反应介质为水-有机溶剂两相体系，有机相为己烷，将pH8.6的Tris-HCl缓冲液，与含有底物奥美拉唑硫醚的己烷混合，形成水-有机溶剂两相反应体系，水相与有机相的体积比为1: 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物不对称氧化制备高对映体纯S‑奥美拉唑的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）将黑曲霉ATCC 9029制成孢子浓度为1×105–1×106孢子/mL的孢子悬浮液，并接种到如下组成的培养基中(w/v)：1.0‑3.0%蛋白胨, 0.5‑1.5%酵母浸膏, 0.05‑0.15% NaNO3, 0.05‑0.15% KH2PO4, 0.01‑0.1% MgSO4·7H2O，初始pH6.0，接种量0.8‑2.0%，32‑35℃培养72‑76小时，用过滤式离心机离心得到湿细胞并固定化，得到固定化细胞；（2）用步骤（1）的固定化细胞催化底物奥美拉唑硫醚不对称氧化合成S‑奥美拉唑，反应在底部通气搅拌反应器中进行，反应介质为水‑有机溶剂两相体系；将pH8.5‑8.9的Tris‑HCl缓冲液，与含有底物奥美拉唑硫醚的有机溶剂混合，形成水‑有机溶剂两相反应体系，水相与有机相的体积比为1:1‑3:1，反应体系中奥美拉唑硫醚浓度为80‑150g/L，加入固定化细胞，使固定化细胞的浓度为2×104‑1.2×105U/L，开始生物催化氧化反应，反应温度33‑35℃，反应时间为60‑70小时，反应结束后滤出固定化细胞，反应液用乙酸乙酯萃取后离心,有机相用无水Na2SO4干燥,蒸出乙酸乙酯，得到产物S‑奥美拉唑，产率为96‑98％，对映体过量率e.e.值为99.5‑99.9%。...
【技术特征摘要】
1.一种微生物不对称氧化制备高对映体纯S-奥美拉唑的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）将黑曲霉ATCC 9029制成孢子浓度为1×105–1×106孢子/mL的孢子悬浮液，并接种到如下组成的培养基中(w/v)：1.0-3.0%蛋白胨, 0.5-1.5%酵母浸膏, 0.05-0.15% NaNO3, 0.05-0.15% KH2PO4, 0.01-0.1% MgSO4·7H2O，初始pH6.0，接种量0.8-2.0%，32-35℃培养72-76小时，用过滤式离心机离心得到湿细胞并固定化，得到固定化细胞；（2）用步骤（1）的固定化细胞催化底物奥美拉唑硫醚不对称氧化合成S-奥美拉唑，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张媛媛，赵兰杰，刘均洪，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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