一种RANKL‑TNF样区融合蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种RANKL‑TNF样区融合蛋白的制备方法。RANKL是由成骨细胞和内皮细胞分泌的一种重要细胞因子，其在骨重建中发挥重要功能。本发明专利技术包括五个步骤：步骤一、获取RANKL功能片段。步骤二、利用RANKL功能片段和载体获得质粒溶液。步骤三、将步骤二得到的质粒载体克隆后转化为BL21菌液。步骤四、对步骤三获得的BL21菌体进行诱导，得到RANKL‑TNF样区融合蛋白溶液。步骤五、对步骤四获得的RANKL‑TNF样区融合蛋白溶液进行蛋白纯化。本发明专利技术采用一种低温且低IPTG浓度的诱导条件，表达出了具有高活性的可溶性目的蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法
本专利技术属于骨因子制备
，具体涉及了RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法。
技术介绍
骨组织是由有机质和无机质组成的，主要为结缔组织，是一种动态的器官。为了维持结构的完整性，同时维持器官矿物质的平衡，骨组织必须不断地进行结构改造和修复；这个过程就是骨的重建。骨的重建主要是指骨的代谢过程，用于调整骨的结构和功能。骨的代谢过程主要涉及到两类细胞，破骨细胞和成骨细胞。破骨细胞主要涉及骨的消化，而成骨细胞在骨基质形成，细胞的矿化中发挥作用，最终分化形成骨细胞和骨衬里细胞。成骨细胞和破骨细胞相互影响同时在各种因子的调节作用下维持骨组织的稳态。骨重建稳态的破坏将导致多种临床上的骨疾病，包括骨质疏松，骨硬化等。骨的重建过程是通过一群具有功能的细胞相互协调而完成的，这个多细胞的群体称为基本多细胞单元(BMU)。基本多细胞单元主要由破骨细胞、成骨细胞、骨衬里细胞、骨细胞、内皮细胞组成，它们通过各种细胞因子相互作用保证了骨重建的正常进行。RANKL是由成骨细胞和内皮细胞分泌的一种重要细胞因子，其在骨重建中发挥重要功能。肿瘤坏死因子配体超家族成员1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RANKL‑TNF样区融合蛋白的制备方法，包括五个步骤；其特征在于：步骤一、获取RANKL功能片段SEQ NO.1，RANKL功能片段SEQ NO.1含有160位精氨酸到318位色氨酸；步骤二、利用RANKL功能片段SEQ NO.1和载体获得质粒溶液，所述的载体为pGST‑4T系列载体；步骤三、将步骤二得到的质粒溶液克隆后转化为BL21菌液；步骤四、在IPTG终浓度为0.1～0.5mM，且温度为16～25℃的条件下对步骤三获得的BL21菌体进行诱导；得到RANKL‑TNF样区融合蛋白溶液；步骤五、对步骤四获得的RANKL‑TNF样区融合蛋白溶液进行蛋白纯化；获得RANKL‑TNF样区融合蛋...

【技术特征摘要】
1.一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法，包括五个步骤；其特征在于：步骤一、获取RANKL功能片段SEQNO.1，RANKL功能片段SEQNO.1含有160位精氨酸到318位色氨酸；步骤二、利用RANKL功能片段SEQNO.1和载体获得质粒溶液，所述的载体为pGST-4T系列载体；步骤三、将步骤二得到的质粒溶液克隆后转化为BL21菌液；步骤四、在IPTG终浓度为0.1～0.5mM，且温度为16～25℃的条件下对步骤三获得的BL21菌体进行诱导；得到RANKL-TNF样区融合蛋白溶液；步骤五、对步骤四获得的RANKL-TNF样区融合蛋白溶液进行蛋白纯化；获得RANKL-TNF样区融合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤一具体如下：将SD大鼠切除卵巢造模，两周后提取其胫骨的总RNA；依照YFRAZMandAFKVR/QDID序列设计简并引物SEQNo.2和反向引物SEQNo.3，简并引物SEQNo.2的序列为5'TAYTTYMGNGCNCARATG3'；反向引物SEQNo.3的序列为5'RTCDATRTCNYGNACYTTRAANGC3'；经逆转录PCR获得RANKL的cDNA；对所得RANKL的cDNA进行纯化操作；以纯化后的cDNA作为模板，设计出初始引物，初始引物的正向引物SEQNo.4序列为5'CCCGGGCAAGCCTGAGGCTCAGC3'；初始引物的SEQNo.5序列为5'CCCGGGTCAGTCTATGTCTTGAACTTT3'；利用初始引物克隆出RANKL功能片段SEQNO.1；RANKL功能片段SEQNO.1含160位精氨酸到318位色氨酸。3.根据权利要求1所述的一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤二具体如下：对RANKL的功能片段进行纯化操作；在20μL纯化后的RANKL功能片段SEQNO.1中加入3μL的10xbuffer、0.3μL的100xBSA、1μL的SmaI和4.7μL的MilliQH2O，进行酶单切；取10μL载体；载体采用pGST-4T系列载体；在载体中加入3μL的10xbuffer、0.3μL的100xBSA、1μL的SmaI和14.7μL的MilliQH2O，进行酶单切；载体和RANKL功能片段的酶单切操作温度均为37℃，酶单切时间均为3小时；对完成酶单切后的载体和RANKL功能片段SEQNO.1分别进行电泳，割胶溶解；得到载体液和RANKL功能片段液；取2μL载体液和6μLRANKL功能片段液分别进行纯化操作后混合并加入1μL的10xT4buffer和1μL的T4DNAligase；得到连接初始体系；连接初始体系在16℃的环境中过夜，得到连接液；取5μl连接液加入内有DH5α化学感受态细胞的培养皿中，冰浴30min；置于42℃环境下热激90s；置于冰上2-3min；置于37℃环境下，加入1mlLB培养液；12...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐家科，周杰，朱思品，肖健，张宏宇，李校堃，
申请(专利权)人：徐家科，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU