一种地龙蛋白的提取方法技术

本发明专利技术公开一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入无水乙醇，浸泡，离心，去除上清；3)加入高氯酸溶液，浸提，离心，抽取上清；4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5‑6，加入硫酸钠粉末，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris‑HCl缓冲液溶解，用DEAE‑Sephadex离子交换法纯化，收集洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。本发明专利技术制备方法简单、周期短，提取效果好、纯度高，得到的地龙蛋白可延长凝血酶时间，有效降低小鼠的BALF中EOS总数。

【技术实现步骤摘要】
一种地龙蛋白的提取方法
本专利技术涉及蛋白质提取领域。更具体地，涉及一种地龙蛋白的提取方法。
技术介绍
地龙是重要的动物药材之一。地龙蛋白提取自地龙，含有胶原酶、纤溶酶、蚓激酶、核酸、微量元素等多种成分，其分子量在5000-10000，属于短链小分子物质。现代研究表明，地龙蛋白含有胶原酶、纤溶酶、核酸、微量元素等多种成分，对体内的凝血系统和纤溶系统具有广泛的影响，既可明显降低血小板黏附率，延长体内血栓形成和溶解体内血栓，又能增加脑血流量，减少脑血管阻力，还能提高红细胞变形能力，从而改善血液流变性和微循环障碍，其药用价值备受重视。但是由于地龙蛋白不稳定，易受酸、碱、离子强度、温度等的影响，因而传统的以水煎入药，影响了其药效的发挥。因此，需要提供一种工艺简单、周期短、提取效果好、纯度高的地龙蛋白的提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种地龙蛋白的提取方法，该提取方法简单、周期短，地龙蛋白的提取效果好、纯度高。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3-4倍体积的无水乙醇，0-4℃浸泡16-24h，离心，去除上清；3)加入浓度为0.05％-0.10％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5-4.5，15-20℃浸提20-30min，离心，抽取上清；4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5-6，加入硫酸钠粉末，处理10-15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.420mMTris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。进一步，所述活性炭的添加量为50-100mg/mL，静置5-10min。进一步，所述加入硫酸钠粉末后使得硫酸钠的饱和度为40-55％。进一步，步骤2)、3)、4)中所述的离心均为以8000-12000r/min的转速离心3-8min。本专利技术中对不加入活性炭利用硫酸铵和硫酸钠沉淀和加入活性炭利用硫酸钠和硫酸铵沉淀制备得到的地龙蛋白的提取效果进行比较，结果表明，未加入活性炭时，硫酸铵进行沉淀的提取效果优于硫酸钠，但是加入活性炭后，硫酸钠进行沉淀的提取效果明显优于硫酸铵，说明当活性炭与硫酸钠结合使用能明显提高硫酸钠的沉淀效果，进而提高地龙蛋白的纯度和提取效果。本专利技术的有益效果如下：本专利技术制备方法简单、周期短、地龙蛋白质量高。本专利技术采用与现有技术不同的提取方法，在提取过程中减少了有机溶液的使用，降低了成本；利用低浓度的高氯酸进行提取，通过活性炭吸附小分子无机物和色素等物质，增强了硫酸钠的沉淀效果，明显提高了地龙蛋白的纯度、提取效率和活性。利用本专利技术制备方法得到的地龙蛋白可延长凝血酶时间，得率超过了25％，并能有效降低小鼠的BALF中EOS总数。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例1一种地龙蛋白的提取方法一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3倍体积的无水乙醇，0℃浸泡16h，以8000r/min的转速离心8min，去除上清；3)加入浓度为0.05％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5，15℃浸提20min，以8000r/min的转速离心8min，抽取上清；4)每毫升上清液中加入50mg活性炭，搅拌并静置5min，以8000r/min的转速离心8min，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为40％，处理10min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.420mMTris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。实施例2一种地龙蛋白的提取方法一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入4倍体积的无水乙醇，4℃浸泡24h，以12000r/min的转速离心8min，去除上清；3)加入浓度为0.1％的高氯酸溶液，调节pH值到4.5，20℃浸提30min，以12000r/min的转速离心8min，抽取上清；4)每毫升上清液中加入100mg活性炭，搅拌并静置10min，以12000r/min的转速离心8min，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至6，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为55％，处理15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.420mMTris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。实施例3一种地龙蛋白的提取方法一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，18℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；4)每毫升上清液中加入75mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为50％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.420mMTris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。实施例4一种地龙蛋白的提取方法一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；4)每毫升上清液中加入60mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为40％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sep本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地龙蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3‑4倍体积的无水乙醇，0‑4℃浸泡16‑24h，离心，去除上清；3)加入浓度为0.05％‑0.10％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5‑4.5，15‑20℃浸提20‑30min，离心，抽取上清；4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5‑6，加入硫酸钠粉末，处理10‑15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris‑HCl缓冲液溶解，与DEAE‑Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris‑HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。

【技术特征摘要】
1.一种地龙蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入3-4倍体积的无水乙醇，0-4℃浸泡16-24h，离心，去除上清；3)加入浓度为0.05％-0.10％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5-4.5，15-20℃浸提20-30min，离心，抽取上清；4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5-6，加入硫酸钠粉末，处理10-15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.220mMTris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩东辉，格日乐，
申请(专利权)人：北京恒大博医中医研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11