一种具有降血压作用的地龙蛋白质是将地龙的４０℃－１００℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为２０００－２４０００的蛋白质（肽）。从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，包括以下的步骤：制备地龙的水提取液、验证地龙的水提取液中含有蛋白质、从地龙的水提取液中提取蛋白质、提纯蛋白质。这种从地龙中提取具有降血压作用的蛋白质的方法，以对血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性影响为指标来选取所提取的蛋白质，方法简便、快速，所提取的蛋白质不但具有显著的降血压作用，无毒副作用，并且对患有高血压大鼠的心、肾等组织病变部分具有明显改善功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
目前，临床上治疗高血压病的一线药物是血管紧张素转换酶抑制剂，大多属于普利(pril)系列，如卡托普利(captoril)、exapril、lisinapril等，是人工合成的含脯氨酸的二肽衍生物，制备这类药物存有工艺复杂的弊端。在我国，中药地龙(蚯蚓)作为降血压药物历史悠久，近年来仍不断见到有关的报道，如中国中西医结合肾病杂志2001年2月第2卷第2期第80页-82页报道的“蚯蚓提取物治疗肾实质性高血压的研究”一文，在这些报道中，使用的都是地龙的水煎剂，至今未见到揭示地龙中降血压成分化学本质这一难题的报道，这在一定程度上妨碍了地龙作为降血压药物的应用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供具有降血压作用的地龙蛋白质；本专利技术的第二个目的是提供从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法。为了实现第一个目的，所提供的具有降血压作用的地龙蛋白质是将地龙的40℃-100℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为2000-24000的蛋白质(肽)。为了实现第二个目的，从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，依次包括以下的步骤1)制备地龙的水提取液按单位是g/ml的重量体积比将1份地龙加入到4份-20份蒸馏水中，在温度为100℃的条件下浸泡，浸泡时间不少于15分钟，制得地龙的水提取液；2)验证地龙的水提取液中含有蛋白质取地龙的水提取液，做12000g、4℃离心4分钟-6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，在扫描图的260nm处和280nm处有吸收峰，证明该地龙的水提取液中含有核酸和蛋白质；3)从地龙的水提取液中提取蛋白质取经过2)步骤离心去沉淀、验证含有蛋白质的地龙水提取液的上清液，上Sephadex G50柱，用流速为0.6ml-1.2ml/min的三蒸水洗脱，用试管收集洗脱液，将这些洗脱液进行200nm-800nm波长扫描，以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)或马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物做血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制试验，然后将具有抑制作用的收集液合并、在低于-15℃的条件下冻干，获得地龙蛋白质初提物，将地龙蛋白质初提物用高压液相层析(HPLC)进行氨基酸种类测定，结果证明含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，该地龙蛋白质初提物即是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)；4)提纯蛋白质将地龙蛋白质初提物经过阴离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析中的任何一种或两种层析，将地龙蛋白质提纯，并进一步进行质谱分析和氨基酸顺序测定。上述1)步骤中的地龙，是洗净的干地龙或经三蒸水洗净、并用静电刺激排除腹腔液的鲜活地龙。上述1)步骤中，之所以将地龙选择在温度为100℃的条件下、浸泡时间不少于15分钟来制得地龙的水提取液，是因为浸泡时间更长、如30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟和105分钟的地龙水提取液中，经测试其蛋白质浓度与浸泡15分钟没有明显差异，对血管紧张素转换酶(ACE)的比抑制活力也非常相似，同时100℃、15分钟也能达到灭菌要求。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的降血压原理是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)在调节血压和体内水电平衡方面具有重要作用，而血管紧张素转换酶(ACE)又在该系统中起关键作用。首先，血管紧张素在肾素的作用下生成10个氨基酸残基的血管紧张素I(AngI)，AngI在ACE的作用下从C-末端水解掉组胺酰亮氨酸，生成具有升高血压作用的8个氨基酸残基的血管紧张素II(Ang II)，Ang II一方面与靶细胞受体结合，使小动脉平滑肌收缩增殖，血管壁增厚，外周阻力增加，另一方面还能使交感神经发放增加、醛固酮分泌增加、体内钠水潴留，最终导致血压升高。近年来的研究表明，人体局部组织Ang II浓度过高，可导致心肌细胞肥大、左心室肥厚、肾小球硬化，对高血压的发生起着重要作用。ACE的另一个天然底物是舒缓激肽(bridykinin)，舒缓激肽具有舒缓血管、降低血压的作用，但ACE使舒缓激肽从C-末端水解掉2个氨基酸残基后，产物便不再具有降低血压的作用。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)一方面能抑制血管紧张素转换酶(ACE)的水解活性，降低了Ang II的生成，从而降低了血压，另一方面又抑制了ACE对舒缓激肽的作用，使舒缓激肽能持续发挥降血压作用。本专利技术所提供的从地龙中制备具有降血压作用的蛋白质的方法，以对血管紧张素转换酶(ACE)的活性影响为指标来选取所提取的蛋白质，方法简便、快速。为了验证所制备的蛋白质在进入体内后具有降血压作用，对自发性高血压大鼠(SHR)进行了试验，结果是具有显著的降血压作用，无毒副作用，对患有高血压大鼠的心、肾等组织病变部分具有明显改善功能。具体实施例方式例1称取5g干地龙，洗净，置于带盖三角瓶内，加入三蒸水100ml，加热到100℃后持续煮20分钟，得地龙的水提取液，取地龙的水提取液做12000g、4℃离心4分钟-6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)或马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物，取0.2ml地龙水提取液的上清液做ACE活性影响试验，同时做SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色，在确认具有ACEI作用后，用冻干机将此上清液冻干，称取0.5g，加入1ml三蒸水，用CTA purifer层析仪上Sephadex G50柱(1.8×70cm)层析，用流速为0.6ml-1.2ml/min的三蒸水洗脱，260nm波长、280nm波长扫描，按每试管1ml收集洗脱液，随之检测各试管的ACEI活性，并计算各试管的比抑制活力，该步较原上清液的比抑制活力提高20.1倍，将具有ACEI活性的各试管洗脱液合并、用冻干机冻干为白色粉末，该白色粉末即是地龙蛋白质初提物，经检验，该地龙蛋白质初提物中含有门冬氨酸4.21％、谷氨酸7.70％、丝氨酸2.59％、甘氨酸2.49％、组氨酸1.10％、精氨酸2.49％、苏氨酸1.94％、丙氨酸3.37％、脯氨酸2.09％、酪氨酸1.42％、缬氨酸2.46％、蛋氨酸0.62％、胱氨酸0.35％、异亮氨酸2.14％、亮氨酸3.73％、苯丙氨酸2.17％、赖氨酸4.74％，用该地龙蛋白质初提物做动物降血压试验并进行例2的分离纯化。比抑制活力的计算方法是在以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)为底物时比抑制活力＝107.2×(标准管228nm吸光度-待测管228nm吸光度)/蛋白浓度；在以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物时，取在228nm每改变0.01nm为一个单位比抑制活力＝100×(标准管228nm吸光度-待测管228nm吸光度)/蛋白浓度；其中蛋白浓度(g/ml)＝1.5×280nm吸光度-0.74×260nm吸光度，或蛋白浓度(g/ml)＝0.75×280nm吸光度。ACE活性检测方法如下1、溶液配制1)、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.1，内含0.1mol/L NaCl)；2)、14m mol/L底物缓冲液，称取41.06mg马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有降血压作用的地龙蛋白质，其特征是将地龙的４０℃－１００℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为２０００－２４０００的蛋白质（肽）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐胜建，任维栋，唐彬，
申请(专利权)人：唐胜建，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]
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