一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。本发明专利技术的方法包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。通过实验证明：本发明专利技术的方法具有工艺操作简单、衔接度高，产品回收率和纯度高的特点，可用于大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌。

【技术实现步骤摘要】
一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。
技术介绍
吡咯喹啉醌(PQQ)属于芳香三环邻位醌，作为核黄素和吡啶核苷酸之后发现的第三种氧化还原酶辅因子。PQQ参与脱氢酶的氧化还原过程，协同COQ完成呼吸链的电子传递，广泛存在于生物体内，具有促进神经生长因子合成与修复、防止神经细胞纤维化、清除自由基以及维护线粒体能量代谢功能等生理功能，在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。化学合成法由于异构体和副产物多、产率低、合成步骤繁琐且需使用多种有毒试剂等问题逐渐被微生物发酵法所替代。甲基营养菌的PQQ合成量高，生丝微菌Hyphomicrobiumsp.TK0441的产量为1g/L(AppliedandEnvironmentalMicrobiology，1992；58(12)：3970-3976)；甲基营养菌Methylovorussp.MP688的产量高达2g/L(CN103224965)，并且培养基组分只需含有甲醇和无机盐，成本低廉、下游纯化工艺较为简单是微生物发酵法合成PQQ产业化的主要生产菌株。因此，开发分离步骤少、衔接度好且回收率高的分离纯化工艺从甲基营养菌发酵液中提取PQQ是产业化的关键步骤。目前，关于发酵液中PQQ的提取方法有络合萃取分离纯化法(CN104892597)、离子对双水相萃取分离结合阴离子交换树脂吸附纯化法(CN105294687)、DEAE-葡聚糖凝胶吸附分离结合C18固相萃取纯化法(CN1138776和US4994382)以及HP-20大孔树脂吸附分离结合聚酰胺柱纯化法(CN104328155)。上述方法需要使用大量的正己烷、甲醇或乙醇等有机溶剂，工业化应用成本高且污染环境。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法。本专利技术提供的从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。上述方法中，所述大孔树脂为非极性大孔树脂。所述非极性大孔树脂的比表面积为800-1000m2/g，平均孔径为15-20nm，优选为美国罗门哈斯公司生产的XAD18、XAD1600N和XAD16N大孔吸附树脂。上述方法中，所述亲水性硅胶填料为亲水性C18硅胶填料，优选为华谱新创科技有限公司生产的C18HC填料。上述方法中，所述步骤(1)前还包括如下步骤：将发酵液离心(10000×g离心5min)，收集上清液；将所述上清液过滤(1KDa的中空纤维膜)，收集滤液。上述方法中，所述步骤(1)，所述洗脱的具体步骤如下：先用缓冲液(pH6.5的0.1M磷酸盐缓冲液)以2BV/h的流速洗脱1BV，再用纯水以2BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色的洗脱液，即为富含吡咯喹啉醌的富集液(PQQ富集液)。上述方法中，所述步骤(3)的方法为用水将所述吡咯喹啉醌母液稀释至浓度为4-5g/L，用浓盐酸或者浓磷酸调节pH至3.0-3.5，析出红褐色固体，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌粗晶体。在本专利技术的具体实施例中，用浓磷酸调节pH至3.5。上述方法中，所述步骤(4)的方法为用水溶解所述吡咯喹啉醌粗晶体，得到浓度为10-15g/L的粗晶体溶液；用氢氧化钠水溶液(1M)调节所述粗晶体溶液的pH至10.0-10.5，再用硫酸溶液(0.25M)调节pH至2.0-3.5，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌。在本专利技术的具体实施例中，用氢氧化钠水溶液(1M)调节所述粗晶体溶液的pH至10.0或10.3或10.5，然后再根据实际需求，在10℃条件下用硫酸溶液(0.25M)调节pH至2.0-3.5：若用硫酸溶液调节pH至2.0时，可得到吡咯喹啉醌晶体；若用硫酸溶液调节pH至3.5时，可得到吡咯喹啉醌二钠盐晶体。上述方法中，所述发酵液为以甲醇为唯一碳源的甲基营养菌发酵液。所述发酵液的具体制备方法如下：在发酵培养基中发酵培养甲基营养菌，得到所述发酵液。上述方法中，所述甲基营养菌可为脱氮生丝微菌Hyphomicrobiumdenitrificans或扭托甲基杆菌Methylobacteriumextorquens。所述脱氮生丝微菌Hyphomicrobiumdenitrificans具体可为脱氮生丝微菌HyphomicrobiumdenitrificansCGMCC10620或脱氮生丝微菌HyphomicrobiumdenitrificansDSM1869；所述扭托甲基杆菌Methylobacteriumextorquens具体可为扭托甲基杆菌MethylobacteriumextorquensCGMCC1.6987。上述方法中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的浓度具体为0.1M，pH具体为6.5。上述方法中，所述静置的条件为(4-10)℃静置12h，所述静置的条件具体为4℃静置12h。本专利技术的另一个目的是提供上述方法的新用途。本专利技术提供了上述方法在制备吡咯喹啉醌中的应用。本专利技术还提供了上述方法在提高吡咯喹啉醌晶体纯度中的应用。本专利技术提供了一种大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌的方法。通过实验证明：本专利技术的方法具有工艺操作简单、衔接度高、产品回收率的特点，且制备得到的吡咯喹啉醌晶体的纯度高于99.5％，晶型单一。附图说明图1为脱氮生丝微菌FJNU-R8发酵液制备的PQQNa2晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。图2为脱氮生丝微菌DSM1869发酵液制备的PQQNa2晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。图3为扭托甲基杆菌1.6987发酵液制备的PQQNa2晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下面实施例中所使用的菌株如下：脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)的菌种，已于2015年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10620。脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)DSM1869为德国菌种保藏中心(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述大孔树脂为非极性大孔树脂。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述亲水性硅胶填料为亲水性C18硅胶填料。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法为用水溶解所述吡咯喹啉醌粗晶体，得到浓度为10-15g/L的粗晶体溶液；用氢氧化钠水溶液调节所述粗晶体溶液的pH至10.0-10.5，再用硫酸溶液调节pH至2.0-3.5，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的方法为用水将所述吡咯喹啉醌母液稀释至浓度为4-5g/L，用磷酸或盐酸调节pH至3.0-3.5，析出红褐色固体，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌粗晶体。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯崇榕，黄建忠，杨欣伟，任洋，魏杰，廖灿，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35