The invention discloses a method for purification of bacterial capsular polysaccharide, inactivated agent Streptococcus pneumoniae fermentation liquid, adding acid to adjust pH value is less than 6.5, precipitation of impurities, centrifugal and microfiltration removal of sediment obtained polysaccharide in the supernatant liquid; ultrafiltration and concentration of polysaccharide solution for clarification with MWCO of 10 - 100KDa film, capsular polysaccharide solution obtained using compound ion exchange chromatography and chromatography hydroxyphosphate gray salt chromatography, the purified capsular polysaccharide solution; ultrafiltration and concentration of capsular polysaccharide solution, and sterile filtration and preservation. Exchange chromatography and hydroxyl phosphate salt composite ion chromatography using gray matter through the combination, can effectively reduce the protein and nucleic acid impurities to less than 1%, the purified polysaccharide product quality is higher than the European Pharmacopoeia standards, the recovery rate was above 60%, the process of the invention is simple and quick, easy to put the big industrial production.
【技术实现步骤摘要】
细菌性荚膜多糖的纯化方法
本专利技术属于生物
,更具体地讲,涉及对细菌性荚膜多糖粗制品的纯化方法。
技术介绍
肺炎链球菌为革兰氏阳性菌,有90多种血清型,其中大部分肺炎链球菌细菌表面包裹一层荚膜多糖。荚膜多糖可逃避免疫系统的识别,防止免疫细胞的吞噬作用,因而使得细菌能够在体内繁殖而致病。多年的研究和临床证明,肺炎链球菌的荚膜多糖作为疫苗能诱导特异性抗体,对相应的肺炎链球菌具有很好的免疫保护作用。不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖的成分和结构都不一样,因而通常需要使用不同血清型的肺炎链球菌的多糖组合作为疫苗来预防主要肺炎链球菌的致病性。用于制备多糖疫苗的肺炎链球菌在发酵培养过程中,除了产生荚膜多糖之外,还产生大量代谢产物。为了满足疫苗制备所必须的荚膜多糖纯度,发酵液通常必须经过多个纯化步骤处理,将多糖粗制品中的蛋白、核酸、内毒素等杂质去除,从而避免后续接种疫苗可能引起的副反应。细菌荚膜多糖纯化工艺的建立经历了多年的发展,传统细菌荚膜多糖纯化工艺采用冷酚萃取法去除蛋白质,该方法需要较长的离心时间,且苯酚作为有一种具有极强腐蚀的试剂,可能腐蚀操作者的皮肤、粘膜甚至抑制操作者的中枢神经或损害肝、肾功能;且废弃苯酚的处理,对环境保护来说存在着较严重的威胁。乙醇分沉淀法通常能够有效地去除多糖中的蛋白污染物,但是难以达到用于注射用的疫苗纯度的要求。另外,乙醇的使用还会带来以下问题:1)乙醇的使用需要防火设施,而设计这样的设施成本很高;2)需要的乙醇量巨大,每升加工材料几乎需要4-6L乙醇,并且废液处理非常困难;3)处理后的多糖复溶困难,需要冻干等步骤。专利US571 ...
【技术保护点】
细菌性荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)灭活剂处理肺炎链球菌发酵培养液,得到包含有细胞碎片、蛋白质、核酸和多糖的细菌溶解液;(2)在步骤(1)获得的细菌溶解液中加酸调节pH值≤6.5,沉淀杂质,离心和微滤去除沉淀物获得多糖澄清液;(3)用截留分子量10—100KDa的膜对步骤(2)获得的多糖澄清液进行超滤换液并浓缩,获得去除大部分可溶性蛋白质、核酸以及大颗粒杂质含量的荚膜多糖溶液;(4)将步骤(3)获得的荚膜多糖溶液组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析进行色谱层析,获得纯化的荚膜多糖溶液;(5)浓缩及超滤步骤(4)获得的荚膜多糖溶液,并进行无菌过滤、保存。
【技术特征摘要】
1.细菌性荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)灭活剂处理肺炎链球菌发酵培养液,得到包含有细胞碎片、蛋白质、核酸和多糖的细菌溶解液;(2)在步骤(1)获得的细菌溶解液中加酸调节pH值≤6.5,沉淀杂质,离心和微滤去除沉淀物获得多糖澄清液;(3)用截留分子量10—100KDa的膜对步骤(2)获得的多糖澄清液进行超滤换液并浓缩,获得去除大部分可溶性蛋白质、核酸以及大颗粒杂质含量的荚膜多糖溶液;(4)将步骤(3)获得的荚膜多糖溶液组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析进行色谱层析,获得纯化的荚膜多糖溶液;(5)浓缩及超滤步骤(4)获得的荚膜多糖溶液,并进行无菌过滤、保存。2.根据权利要求1所述的细菌性荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,步骤(2)中所加的酸是磷酸、乙酸、盐酸、硫酸或硝酸中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的细菌性荚膜多糖的纯化...
【专利技术属性】
技术研发人员:祝先潮,陈春光,
申请(专利权)人:浙江博和瑞达生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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