一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法技术

本发明专利技术属于细胞中油脂含量检测技术领域，具体涉及一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法。包括以下步骤：菌体活化，得到活化的真菌细胞；液体摇瓶培养，得到真菌细胞培养液；利用真菌细胞培养液制备菌悬液；苏丹黑染色；油脂含量计算的步骤。该方法与热酸解法提取油脂相比的误差小，并且本发明专利技术的方法可以定量检测油脂含量，方便快捷，节省时间和试剂，又避免了环境的污染，方便产油真菌育种工作的高产油脂菌株筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法
本专利技术属于细胞中油脂含量检测
，具体涉及一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法。
技术介绍
生物柴油是一种较为洁净的合成油，主要是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂等为原料制备而成，是一种可以代替石化柴油的再生性燃料。上述原料中油脂含量检测是制备生物柴油的前提，也是高效筛选优良产油原料的关键。现有的细胞中油脂检测方法主要有：利用尼罗红染色法、铜试剂法、傅里叶变换红外光谱法以及气质联用法。尼罗红染色法通过尼罗红与脂类物质的结合并发出荧光检测信号，可以快速检测活细胞内的脂类组分，但是其受不同材料细胞大小的影响，需要不断更新条件，以减少误差。罗红染色法通过尼罗红与脂类物质的结合并发出荧光检测信号，可以快速检测活细胞内的脂类组分，但是其受不同材料细胞大小的影响，需要不断更新条件，以减少误差。铜试剂法不能绝对定量，需要称重法或标准脂肪酸进行定量。傅里叶变换红外光谱法以及气质联用法对设备要求较高，成本较高。因此，需要开发一种快速高效、操作步骤简单的检测真菌中性油脂的方法。
技术实现思路
本专利技术提供的一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，解决了现有技术真菌细胞中油脂检测比较困难的问题，是一种快速高效、操作步骤简单的检测真菌中性油脂的方法，方便产油真菌育种工作的高产油脂菌株筛选。本专利技术目的是提供一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，包括以下步骤：S1，菌体活化，得到活化的真菌细胞；S2，液体摇瓶培养，得到真菌细胞培养液；S3，利用真菌细胞培养液制备菌悬液；S4，苏丹黑染色取菌悬液，离心收集菌体；加一定量的苏丹黑染液，染色30-60min；离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清；加70％乙醇清洗，离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清，收集固体沉淀；将固体沉淀转移至载玻片，然后加水悬浮，制成水装片；S5，中性油脂含量计算观察水装片上的细胞内黑色油滴，选取着色均匀的视野，测量视野中的单个细胞的体积V，同时测量该细胞内油滴数目i与相应油滴的体积vi，代入公式X％＝(∑vi)/V计算中性油脂含量体积百分比，根据M％＝d1∑vi/[d1∑vi+d2(V-∑vi)]计算中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，其中，i表示油滴数目，vi表示第i个油滴的体积，V代表单个真菌细胞体积，X％表示中性油脂含量体积百分比，M％表示中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，d1表示中性油脂的密度，d2表示水的密度。优选的，上述的快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，所述苏丹黑染色的步骤为：吸取1ml菌悬液，8000r/min离心3min，收集菌体；加一定量的苏丹黑染液，染色30-60min；8000r/min离心3min，弃上清；加无菌水清洗，8000r/min离心3min，弃上清；加70％乙醇清洗，8000r/min离心3min，弃上清；加无菌水清洗，8000r/min离心3min，弃上清，收集固体沉淀；将固体沉淀转移至载玻片，然后加水悬浮，制成水装片。优选的，上述的快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，对于丝状的真菌细胞，V＝(3/4)πr2h，其中,π为圆周率，r为真菌细胞半径，h是菌体细胞长度。优选的，上述的快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，对于球形的真菌细胞，V＝(4/3)πr3，其中，π为圆周率，r为真菌细胞半径。优选的，上述的快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，对于椭球型的真菌细胞，V＝(3/4)πabc，其中，π为圆周率，a为真菌细胞沿x轴的赤道半径，b为真菌细胞沿y轴的赤道半径，c为真菌细胞沿z轴的极半径。与现有技术相比，本专利技术提供的一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，具有以下有益效果：(1)苏丹黑染色定量油脂含量方便快捷，节省时间和试剂，又避免了环境的污染，方便产油真菌育种工作的高产油脂菌株筛选。解决了真菌细胞中油脂检测比较困难的问题，方便产油真菌育种工作的高产油脂菌株筛选。(2)方便直观，成本较低，操作简单。不同材料因其细胞形状、大小、结构不同，苏丹黑染色特性也不同，选择合适的染色条件使油脂准确定量，其中，对于丝状的真菌细胞，采用V＝(3/4)πr2h计算含量，对于球形的真菌细胞，采用V＝(4/3)πr3计算含量，对于椭球型的真菌细胞，采用V＝(3/4)πabc计算含量，减少误差。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及到数据范围的，在该数据范围内包括两个端点的任何数值均可实现，由于效果和步骤相同，故不赘述。下述实施例1-3中水的密度以1g/cm3计，中性油脂密度以0.92g/cm3计。实施例1一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，该真菌细胞为假丝酵母细胞，属于丝状真菌细胞，包括以下步骤：S1，菌体活化，得到活化的真菌细胞用接种针无菌操作蘸取假丝酵母(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC1366)斜面母种上菌苔，四区划线于菌种活化培养基平板，置培养箱内28℃培养72h，观察菌苔丰满、略呈红色，检查无杂菌污染可得到活化的假丝酵母。其中，每升所述菌种活化培养基采用PDA培养基，的制备方法为：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小块，称取200g，煮沸半小时，四层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖和16g的琼脂，完全溶解后，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌30min，自然pH。S2，液体摇瓶培养，得到真菌细胞培养液。将活化的假丝酵母接种于种子培养基中，在温度为26-30℃，转速180转/分钟的恒温振荡培养箱中培养5-6d，得到假丝酵母种子液；将假丝酵母种子液接种于液体摇瓶发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，在温度为26-30℃，转速180转/分钟的恒温振荡培养箱中培养5-6d，得到假丝酵母种子培养液。其中，每升种子培养基(GMY)含有：磷酸二氢钾8g、七水合硫酸镁0.5g、酵母膏3g、葡萄糖40g、溶剂为水，pH为5.5；液体摇瓶发酵培养基采用GMY40培养基，每升GMY40培养基含有：40g的葡萄糖，3g的酵母提取物，8g的KH2PO4，0.5g的MgSO4·7H2O，溶剂为水，pH为6.0。S3，利用真菌细胞培养液制备菌悬液把假丝酵母培养液4℃、8000r/min离心5min收集菌体，用高纯水洗涤一次，用高纯水稀释得到合适的细胞密度的假丝酵母菌悬液，4℃保存备用；S4，苏丹黑染色吸取1ml假丝酵母菌悬液，8000r/min离心3min，收集菌体；加0.4mL的苏丹黑染液，染色30-60min；8000r/min离心3min，弃上清；加无菌水清洗，8000r/min离心3min，弃上清；加70％乙醇清洗，8000r/min离心3min，弃上清；加无菌水清洗，8000r/min离心3min，弃上清，收集固体沉淀；将固体沉淀转移至载玻片，然后加水溶解，制成水装片。其中，苏丹黑染液的配制方法如下：0.5g苏丹黑B溶于100ml70％酒精中，水浴加热煮沸，全部溶解后趁热过滤，冷却后冰箱4℃保存备用，恢复至室温后使用。S5，中性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，菌体活化，得到活化的真菌细胞；S2，液体摇瓶培养，得到真菌细胞培养液；S3，利用真菌细胞培养液制备菌悬液；S4，苏丹黑染色取菌悬液，离心收集菌体；加苏丹黑染液，染色30‑60min；离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清；加70％乙醇清洗，离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清，收集固体沉淀；将固体沉淀转移至载玻片，然后加水悬浮，制成水装片；S5，中性油脂含量计算观察水装片上的细胞内黑色油滴，选取着色均匀的视野，测量视野中的单个细胞的体积V，同时测量该细胞内油滴数目i与相应油滴的体积vi，代入公式X％＝(∑vi)/V计算中性油脂含量体积百分比，根据M％＝d1∑vi/[d1∑vi+d2(V‑∑vi)]计算中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，其中，i表示油滴数目，vi表示第i个油滴的体积，V代表单个真菌细胞体积，X％表示中性油脂含量体积百分比，M％表示中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，d1表示中性油脂的密度，d2表示水的密度。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测真菌细胞内中性油脂含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，菌体活化，得到活化的真菌细胞；S2，液体摇瓶培养，得到真菌细胞培养液；S3，利用真菌细胞培养液制备菌悬液；S4，苏丹黑染色取菌悬液，离心收集菌体；加苏丹黑染液，染色30-60min；离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清；加70％乙醇清洗，离心，弃上清；加无菌水清洗，离心，弃上清，收集固体沉淀；将固体沉淀转移至载玻片，然后加水悬浮，制成水装片；S5，中性油脂含量计算观察水装片上的细胞内黑色油滴，选取着色均匀的视野，测量视野中的单个细胞的体积V，同时测量该细胞内油滴数目i与相应油滴的体积vi，代入公式X％＝(∑vi)/V计算中性油脂含量体积百分比，根据M％＝d1∑vi/[d1∑vi+d2(V-∑vi)]计算中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，其中，i表示油滴数目，vi表示第i个油滴的体积，V代表单个真菌细胞体积，X％表示中性油脂含量体积百分比，M％表示中性油脂占据真菌细胞的重量百分比，d1表示中性油脂的密度，d2表示水的密度。2.根据权利要求1所述的快速检测真菌细胞内中性油脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁峰，刘秀花，梁梁，
申请(专利权)人：商丘师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41