本发明专利技术公开了一种快速检测脂肪细胞内甘油三酯含量的试剂盒，试剂盒主要包括用丙酮和DMSO作为溶剂的尼罗红工作液、PBS。并提供一种细胞内甘油三酯荧光染色方法。与传统的油红O染色方法相比，此试剂盒的操作方法更简单、耗时短、效率高、通量大、杂质少，更易于用户观察，并可以在短时间内对脂肪细胞内甘油三酯进行定量。因此，此发明专利技术更适用于当前脂肪细胞分化的研究工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油=醋检测试剂盒，属于生物试 剂
技术介绍
在体外，前脂肪细胞经诱导后(膜岛素、地塞米松、IBMX等）分化为成熟脂肪细胞， 分化过程中，细胞胞质中产生甘油=脂并逐渐积聚形成圆形脂滴（lipid化oplet)。脂滴的 数量和积聚程度可W作为表型值用于评估前体脂肪细胞分化程度。目前，一般使用亲脂染 料染色并萃取检测吸光度的方法对成熟脂肪细胞中的脂滴进行定量和定性。 油红0可W将成熟脂肪细胞中的脂滴染成红色，同时，用异丙醇萃取后检测吸光 度可W对甘油=醋的多少进行量化。因此，一直W来油红0染色被认为是一种经典的脂滴 染色方法。但随着细胞实验技术的快速发展，实验精度的要求也越来越高，经典的油红0染 色法也暴露出了自身的一些缺陷，如：染色时细胞需要固定和反复清洗，时间长且易破坏细 胞层；油红0工作液在使用前需要过滤，否则染色后会出现油红残渣，影响观察；染色后不 易将多余染液洗尽，导致异丙醇萃取后检测出来的吸光度偏高；饱和油红0液体保存太久 颜色会变得深黑，影响使用；在长时间操作过程中，挥发的异丙醇会影响实验者的健康。 为了克服油红0染色法的缺陷，本专利技术使用稳定性较好的巧光染料尼罗红，经发 明者多次实验，成功探索出用于成熟脂肪细胞脂滴染色的尼罗红染液。与经典油红0染色 相比，尼罗红染色具有步骤简单、通量高、耗时少、对实验者伤害小等特点，且巧光染色更易 观察和定量细胞中的脂滴，因此，尼罗红染色更适用于当前脂肪细胞分化的研究工作。
技术实现思路
阳〇化]在本专利技术旨在克服经典油红0染色方法的技术缺陷，使用巧光染料尼罗红，提供 一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油=醋检测试剂盒及其检测方法。该方法操作简易、 通量高、耗时少、重复性好、准确率高。 一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油=醋检测试剂盒，试剂包括尼罗红工作 液。 专利技术者将丙酬和DMSO作为尼罗红的溶剂，设计表2所示的7个浓度配比组合，并 设计尼罗红终浓度为Img/ml和0.Img/ml。通过染色已分化完全的猪脂肪细胞，发现0.Img/ ml巧光强度明显弱于Img/ml(见附图1)，因此后续实验浓度定为Img/ml。配方1至配方 7溶解尼罗红使其终浓度为Img/ml，避光保存一个月后，染色分化15天的猪脂肪细胞，比较 分析巧光图片(见附图2-4)和酶标仪定量数据(见附图5)，结果发现放置一段时间后配方 1/2/3染色效果变差，染色后底层细胞完全卷曲成球状，OD值很低，配方4/6/7在一定程度 上也会破坏细胞层的完整性，且OD值差异较大，最终筛选出20%丙酬+80%DMS0是尼罗红最 佳溶剂组合。经实验探索后得到最佳尼罗红工作液的配制方法，W配制IOml为例：准确称 量10.OOmg尼罗红粉末，溶于IOml由20%丙酬和80%DMS0组成的溶剂中，溶解后于4°C避光 保存。 表2.尼罗红溶剂比例设计。 本专利技术提供一种成熟脂肪细胞内甘油S醋检测方法，包括W下步骤： 步骤1 :前脂肪细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板取出培养箱，小屯、吸去培养 液，PBS清洗两次，注意不要损坏底层细胞； 步骤2 :清洗后，每孔加入对应量的PBS; 步骤3 :加入与孔板对应量的尼罗红工作液，室溫（20-25°C)避光解育IOmin; 步骤4 :孔板置于酶标仪中，设置485nm/572nm波长检测巧光强度； 步骤5:用巧光显微镜拍照。 本专利技术利用稳定性较好的巧光染料尼罗红，可从陕速与细胞内甘油S醋特异性着 色，能清晰观察脂肪细胞内脂滴，同时可W用酶标仪准确检测光度值，准确快捷。 本专利技术操作步骤简单，此法不需要固定细胞和多次PBS清洗，大大减少实验时间 和多次清洗对细胞的损伤(分化后的脂肪细胞贴壁能力下降)，且配制好尼罗红工作液可W 多次使用，无需每次过滤或其他处理，简洁易操作。 本专利技术方法通量高，对于96孔板，使用排枪一次性可W检测多个孔板；对于孔数 目更少的板来讲，一次性可W检测的数量更多。因此，此法在保证高准确度和操作简单的情 况下，更适用于现代细胞生物学研究。【附图说明】 图1是尼罗红染色比较(配方1至7尼罗红浓度均为Img/ml;配方1. 1至1. 7尼 罗红浓度均为0.Img/ml)。 图2是尼罗红染液配制保存30天后染色比较(配方1至3)。 图3是尼罗红染液配制保存30天后染色比较(配方4至7)。 图4是尼罗红染液配制保存30天后染色比较細红0)。 图5是不同配方尼罗红染色OD值检测。[001引图6是藏猪脂肪细胞分化12天尼罗红染色OD值检测。 图7是藏猪脂肪细胞分化12天尼罗红染色与油红0染色比较。【具体实施方式】 实施例： 从出生后2天的藏猪颈背部皮下脂肪组织中分离提纯前体脂肪细胞，用鸡尾酒法 (Insulin、Dex、IBMX)+罗格列酬诱导分化，分化后第12天的细胞用于实验。实验中使用本 专利技术5号配方，详细步骤如下： 步骤I :藏猪前体脂肪细胞于96孔板中诱导分化至12天，从培养箱中取出孔板，小屯、 吸去培养液，注意枪头不要触及底层细胞； 步骤2: PBS清洗两次（200 Ul/孔)，动作尽量轻缓，清洗后，每孔加入200 UlPBS;步骤3 :加入5 Ul尼罗红工作液，室溫（20-25°C)避光解育5min ; 步骤4 :孔板置于酶标仪中，设置485nm/572nm波长检测巧光强度； 步骤5:用巧光显微镜拍照。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可W根据上述说明加W改进或变换， 而所有运些改进和变换都应属于本专利技术所附权利要求的保护范围。【主权项】1. 一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，包括尼罗红、 丙酮、DMSO、PBS。2. 所述尼罗红工作液，以配制10ml为例：准确称量10.OOmg尼罗红粉末，溶于10ml溶 剂中，溶剂为含有20%丙酮和80%DMS0的混合液，溶解后于4°C避光保存。3. -种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒，包括以下步骤： 步骤1 :前脂肪细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板取出培养箱，小心吸去培养 液，PBS清洗两次，注意不要损坏底层细胞 步骤2 :清洗后，每孔加入对应量的PBS(见表1) 步骤3 :加入与孔板对应量的尼罗红工作液，室温（20-25°C)避光孵育5min 步骤4 :将孔板置于酶标仪中，设置激发波长/发射波长=485nm/572nm，检测荧光强度 步骤5:用荧光显微镜拍照。【专利摘要】本专利技术公开了一种快速检测脂肪细胞内甘油三酯含量的试剂盒，试剂盒主要包括用丙酮和DMSO作为溶剂的尼罗红工作液、PBS。并提供一种细胞内甘油三酯荧光染色方法。与传统的油红O染色方法相比，此试剂盒的操作方法更简单、耗时短、效率高、通量大、杂质少，更易于用户观察，并可以在短时间内对脂肪细胞内甘油三酯进行定量。因此，此专利技术更适用于当前脂肪细胞分化的研究工作。【IPC分类】C12Q1/61【公开号】CN105296599【申请号】CN201510613673【专利技术人】张进威, 王讯, 罗毅, 王鹏俊, 李明洲 【申请人】四川农业大学【公开日】2016年2月3日【申请日】2015年9月24日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，包括尼罗红、丙酮、DMSO、PBS。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张进威，王讯，罗毅，王鹏俊，李明洲，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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