样品制备方法技术

本公开内容提供了制备用于测序的核酸样品的单扩增法和双扩增法。

Sample preparation method

The present disclosure provides single amplification methods and double amplification methods for preparing nucleic acid samples for sequencing.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】样品制备方法交叉引用本申请要求2014年9月24日提交的序列号为62/054,886的美国临时申请和2015年4月20日提交的第14/691,457号美国专利申请的优先权，其通过引用而整体并入本文。联邦赞助研究声明本专利技术是在由国立卫生研究院授予的GM098741下由政府支持而完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
尽管近年来核酸测序的成本已经降低，但样品制备仍然费用高昂。只有几种样品制备方法与最流行的测序平台相兼容。这些方法可能费用高昂且又耗时。特别是，文库制备可能需要在核酸片段上生成突出的碱基。该步骤是制备测序文库较为低效的一步步骤。提高该步骤的效率将减少制备测序文库所需的起始核酸的量。需要用于测序的样品制备的新方法，特别是借此提高生成具有突出碱基的核酸片段的效率的方法。
技术实现思路
本文提供了用于生成核酸片段的衔接子连接的文库的方法。特别地，公开了用于制备部分互补的双链核酸片段的方法，使得一条链延伸超出另一条以产生突出端。这样的突出端可以提高酶促反应和生化反应的效率。例如，这样的突出端可与其互补序列退火，以允许核酸片段的靶向配对。在另一实例中，具有互补突出端的核酸片段的连本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生成双链核酸分子的衔接子连接的文库的方法，其包括在单一反应容器或反应混合物中：(a)由多个单链多核苷酸生成包含一条或两条链的可切割5’端的多个双链DNA分子；(b)用切割剂切割所述可切割5’端以产生包含一个或多个突出端的双链DNA分子；以及(c)使包含3’突出端的一个或多个双链衔接物与所述具有一个或多个突出端的双链DNA分子相连接，从而形成所述衔接物连接的文库；以及，可选地，(d)对所述衔接物连接的文库进行测序，其中所述多个单链多核苷酸以小于约5纳克的量存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.24 US 62/054,886;2015.04.20 US 14/691,4571.一种用于生成双链核酸分子的衔接子连接的文库的方法，其包括在单一反应容器或反应混合物中：(a)由多个单链多核苷酸生成包含一条或两条链的可切割5’端的多个双链DNA分子；(b)用切割剂切割所述可切割5’端以产生包含一个或多个突出端的双链DNA分子；以及(c)使包含3’突出端的一个或多个双链衔接物与所述具有一个或多个突出端的双链DNA分子相连接，从而形成所述衔接物连接的文库；以及，可选地，(d)对所述衔接物连接的文库进行测序，其中所述多个单链多核苷酸以小于约5纳克的量存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割5’端选自：rA、rC、rG、rU或dU。3.根据权利要求1所述的方法，其中以高于90％的效率进行所述连接。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生成包括：(a)使所述多个单链多核苷酸与第一引物库相接触，其中来自该第一库的每个引物包含可切割5’端；(b)延伸来自所述第一库的引物以生成与所述单链多核苷酸杂交的第一延伸产物，从而形成第一双链双链体；(c)使所述第一双链双链体变性为单链；(d)使所述第一多核苷酸延伸产物与第二引物库杂交，其中来自该第二库的每个引物可选地包含可切割5’端；(e)延伸来自所述第二库的引物以生成与所述第一延伸产物杂交的第二延伸产物，从而形成第二双链双链体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一引物库和所述第二引物库为包含5’可切割端的随机引物库。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一引物库包含随机引物，而所述第二库包含靶标特异性引物。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一引物库包含靶标特异性引物，而所述第二库包含随机引物。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一引物库包含靶标特异性引物，而所述第二库包含靶标特异性引物。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶标特异性引物包含位于所述靶标特异性序列上游的随机化条码序列。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶标特异性引物包含位于所述靶标特异性序列上游的随机化条码序列。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一靶标特异性引物库和第二靶标特异性引物库包含位于所述靶标特异性序列上游的条码序列。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生成包括：(a)使多个多核苷酸与包含可切割5’端的引物库相接触；(b)延伸所述引物以生成与所述多核苷酸杂交的第一延伸产物，从而形成双链双链体；(c)切割所述可切割5’端，从而生成具有第一突出端的双链双链体；以及(d)使一个或多个衔接子与(c)中的所述双链双链体相连接，其中所述一个或多个衔接子包含与所述第一突出端互补的突出端，其中所述方法仅包括一轮延伸。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述引物库包含随机引物。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述引物库包含靶标特异性引物。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶标特异性引物包含位于所述靶标特异性序列上游的条码序列。16.一种用于生成双链核酸分子的衔接子连接的文库的方法，其包括在单一反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·邓纳姆，
申请(专利权)人：赛科恩斯生物科学公司，南加利福尼亚大学，
类型：发明
国别省市：美国,US