一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂制造技术

本发明专利技术涉及免疫学领域，公开了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其主要包括以下步骤：(1)Eu

A time resolved fluorescence immunoassay for quantitative detection of beta agonists in animals

The invention relates to the field of immunology, and discloses a time resolved fluorescence immunochromatographic method for quantitatively detecting beta doping in animals, which mainly comprises the following steps: (1) Eu;

【技术实现步骤摘要】
一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂
本专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。
技术介绍
β兴奋剂(β肾上腺受体激动剂)的药物，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗等，β兴奋剂容易在动物机体内大量蓄积，维持较高的残留量，所以畜产品一旦携有，一般烹饪方法和过程都很难将其清除或使其失活、溶解、损耗，因而严重影响到人类的健康。欧美等国早已立法禁止在畜禽生产上使用β兴奋剂，而我国农业部也作出相同的规定，尽管如此，受经济利益的驱使，违法滥用β兴奋剂现象仍然比较普遍。目前针对β兴奋剂的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等，色谱技术最常用，主要有高压液相色谱(HPLC)，高压液相色谱/荧光(HPLC/FLD)，液相色谱-质谱连用(LC-MS)，气象色谱-质谱(GC-MS)连用，毛细管电泳等方法。这些方法灵敏准确，但是样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人士来操作复杂的仪器设备。而酶联免疫分析技术灵敏、特异、快速，一次能检测大量样品，但该方法也需酶标仪等仪器设备，分析时间一般为1～4小时，对β兴奋剂检测仍具有一定的局限，因此，急需发展一种简便、快速、适于现场的β兴奋剂检测方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中操作复杂、成本高、时间长的缺点，提供了一种简便、快速、适于现场的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括以下步骤，步骤一，Eu3+标记的羊抗鼠IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗鼠IgG，经蛋白质脱盐柱(PD-10)柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗鼠IgG与0.5mg的Eu3+-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖(SepharoseCL-6B)柱中分馏，分馏物即为Eu3+标记的羊抗鼠IgG；步骤二，Sm3+标记的羊抗兔IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗兔IgG，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗兔IgG与0.5mg的Sm3+-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在SepharoseCL-6B柱中分馏，分馏物即为Sm3+标记的羊抗兔IgG；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/L、pH7.8含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/mL的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/L、pH7.8含有0.05％NaN3和0.9％NaCl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/L作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/L含有0.05％Tween20的Tris-HCl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/L、pH7.2含有0.5％OVA，0.9％NaCl，0.05％NaN3的Tris-HCl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。步骤五，取步骤四所得的包被板，加入步骤三所得标准品或已处理好的样品到各自微孔中，再加入步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，震荡孵育后用洗脱液洗涤次，再加入增强液，震荡孵育，用半自动荧光检测仪进行检测。作为优选，取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或已处理好的样品，加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/L、pH7.4含有0.9％NaCl和0.4％～0.6％甲醇的Tris-HCl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。作为优选，增强液为0.1mol/L、pH3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％TritonX-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。作为优选，样品为尿液或血液，样品处理：尿液以3000r/min离心5min，之后用生理盐水稀释10倍；将0.5mL血液用0.5mL、pH7.4、10mmol/L的PBS缓冲液稀释10倍。Eu3+-DTTA、Sm3+-DTTA均购自TianjinRadio-MedicalInstitute。时间分辨荧光免疫层析法其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量。本专利技术由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：甲醇可以提高标记物的溶解度和评估其在时间分辨荧光免疫层析法中的效果；在时间分辨荧光免疫层析法采用Eu3+标记羊抗鼠IgG和Sm3+标记羊抗兔IgG，测量时，通过检测Eu3+和Sm3+可以同时检测样品中是否含有莱克多巴胺(RAC)和沙丁胺醇(STL)。本专利技术具有稳定性佳、灵敏度高及重复性好的优点。具体实施方式下面实施例是对本专利技术进一步详细描述，但不是限制本专利技术的范围。对比例1ELISA试剂盒测定β兴奋剂：将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋，封口，保存于2～8℃；洗涤工作液在使用前也需回温；将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；酶结合物工作液配制：根据需要量用浓缩酶结合物稀释液将浓缩酶结合物按1:10的比例稀释成酶结合物工作液(即1份浓缩酶结合物加入到10份浓缩酶结合物稀释液中)；加标准品/样本及酶结合物工作液：加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，然后加入配制好的酶结合物工作液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min；洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液。实施例1一种时间分辨荧光免疫层析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于，包括以下步骤；步骤一，Eu

【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于，包括以下步骤；步骤一，Eu3+标记的羊抗鼠IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗鼠IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗鼠IgG与0.5mg的Eu3+-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Eu3+标记的羊抗鼠IgG；步骤二，Sm3+标记的羊抗兔IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗兔IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗兔IgG与0.5mg的Sm3+-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Sm3+标记的羊抗兔IgG；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/L、pH7.8含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/mL的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/L、pH7.8含有0.05％NaN3和0.9％NaCl的碳酸盐缓冲液4...

【专利技术属性】
技术研发人员：周斌，王树明，
申请(专利权)人：杭州泰熙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33