一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法，所示方法包括以下步骤：1)细胞培养，2)细胞染毒，3)γH2AX的免疫荧光标记，4)高内涵技术定量分析。本发明专利技术的优点在于：利用高内涵成像系统自动成像，定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物诱导产生的DNA双链断裂标志物γH2AX蛋白质，实现了细胞的直接、快速检测，使得样本处理更为方便；高分辨率的成像，不仅使γH2AX在细胞核内的分布可直接观测而且使图像资料便于存储和再分析，并且可以实现对亚硝胺或亚硝胺代谢物在每个细胞核内诱导的γH2AX进行定量分析，检测结果更为灵敏和准确。

Method for quantitatively analyzing DNA damage caused by nitrosamine or nitrosamine metabolite based on high content technology

The invention discloses a method for quantitative analysis of technology of high content cellular DNA damage induced by nitrosamine or nitrosamine metabolites based on the shown method comprises the following steps: 1) cell culture, 2) cells, 3) immunofluorescence labeling of H2AX gamma, 4) quantitative analysis of high content of technology. The invention has the advantages of high content imaging system using automatic imaging, quantitative analysis of nitrosamines or nitrosamine metabolites induced by double strand breaks of DNA marker H2AX protein gamma, realize direct and rapid detection of cells, so that the sample processing is more convenient; high resolution, not only makes the gamma distribution of H2AX in the the nucleus can be observed directly and is convenient for storage and analysis of image data, and can realize the quantitative analysis of gamma H2AX nitrosamines or nitrosamines metabolites in each nucleus induced by the detection result is more sensitive and accurate.

【技术实现步骤摘要】
一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法
本专利技术属于DNA损伤体外检测
，更具体而言，本专利技术涉及亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的体外定量分析方法。
技术介绍
烟草特有亚硝胺类物质，如NNN、NNK是烟草及烟气中一类特有的且典型的N-亚硝胺类物质，目前有足够的证据表明NNK和NNN是强烈的啮齿动物致癌剂。NNN和NNK在代谢过程中所产生的亲电中间体，可以与DNA形成加合物并保持在啮齿动物的鼻腔黏膜、肺、肝、胰组织中，从而诱发相关靶组织的癌变。目前世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究组织(IARC)已经将烟草特有亚硝胺类物质NNN及NNK列为1类致癌物，同时世界卫生组织烟草控制框架公约(FCTC)将NNN及NNK列为烟气优先级管制污染物之一。因此，准确检测烟草特有亚硝胺类物质NNN及NNK对细胞DNA的损伤对于烟草特有亚硝胺类物质的遗传毒性和危害性评价具有重要的意义。DNA双链断裂是DNA最严重的一种损伤形式，如果这种损伤不能被正确或者及时修复就可能会导致染色体畸变或者细胞凋亡等。作为DNA双链断裂的一种生物标志物，磷酸化组蛋白γH2AX已经被广泛地应用于临床医药学、放射学及毒理学等研究方面。包括很多单体化合物和混合物通过γH2AX实验对其遗传毒性进行了测定和评价。例如，Tanaka等利用γH2AX实验对卷烟烟气冷凝物的遗传毒性进行了检测和评价；Smart等采用γH2AX实验对依托泊苷、米托蒽醌及甲基亚硝脲的DNA双链断裂的剂量-效应关系进行了研究。该实验因其灵敏性高、结合其他仪器检测技术可以进行大规模分析检测，拥有其他遗传毒性检测技术并不具备的多种优点，目前已经被广泛地应用于化合物和有毒物质的遗传毒性筛选和评价。目前对γH2AX进行分析检测的主要方法有流式细胞仪、ELISA(酶联免疫吸附试验)、WesternBlot(蛋白质印迹)、显微镜技术等。流式细胞仪和WesternBlot操作繁琐，检测前需要将贴壁细胞酶解成单细胞悬液，破坏了细胞的结构和功能完整性，且检测通量较低。ELISA不能提供细胞内荧光焦点的分布情况且需要额外添加其他检测蛋白对结果进行校正，而显微镜技术的检测通量低，且人为计数的误差较大。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种无需破坏细胞、简单、有效且灵敏度高的亚硝胺或亚硝胺代谢物致DNA损伤的定量分析方法，该方法的检测结果准确并且可视化，以克服现有技术的缺陷。本专利技术的目的通过将高内涵技术和γH2AX的定量分析相结合而实现。具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含亚硝胺或亚硝胺代谢物和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。优选地，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；更优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO2条件下培养24h。优选地，所述步骤2)中，亚硝胺是指含有亚硝基的化合物，亚硝胺代谢物是指亚硝胺的羧酸盐类代谢物，例如乙酸盐代谢物；更优选地，所述亚硝胺为NNN(N'-亚硝基降烟碱)或NNK(4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)，所述亚硝胺代谢物为NNN或NNK的羧酸盐代谢物，例如NNN-乙酸盐(N'-亚硝基降烟碱乙酸盐)或NNK-乙酸盐(4-(乙酰羟甲基酯)-亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮)；更优选地，所述细胞染毒液中亚硝胺的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为15.63-500μg/mL；或者，所述细胞染毒液中亚硝胺代谢物的浓度为0-235.24μg/mL，优选>0且≤235.24μg/mL，更优选为0.92-235.24μg/mL；或者，所述细胞染毒液中亚硝胺代谢物的浓度为0-132.64μg/mL，优选>0且≤132.64μg/mL，更优选为0.52-132.64μg/mL；根据本专利技术的具体实施方式，所述细胞染毒液中亚硝胺的浓度可以是0、15.63、31.25、62.5、125、250或500μg/mL，或者所述细胞染毒液中亚硝胺代谢物的浓度可以是0、0.92、1.84、3.68、7.35、14.70、29.41、58.81、117.62、176.43或235.24μg/mL，或0、0.52、1.04、2.07、4.14、8.29、16.58、33.16、66.32或132.64μg/mL。优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。优选地，所述步骤3)包括：3-1)吸弃所述细胞染毒液，洗涤细胞，加入多聚甲醛进行细胞固定；3-2)洗涤细胞，然后加入Triton-100X以使细胞通透；3-3)洗涤细胞，然后加入血清白蛋白封闭，之后加入一抗即抗γH2AX抗体进行孵育；3-4)洗涤细胞，然后加入免疫荧光标记的二抗进行孵育；3-5)洗涤细胞，加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行染色；3-6)洗涤细胞，保存。优选地，所述步骤4)中，所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定分别在两组不同的激发波长和发射波长下进行；优选地，所述步骤3-4)中，免疫荧光标记的二抗为AlexaFluor488标记的二抗，并且所述步骤4)中，在通道一中以激发波长358nm和发射波长461nm进行细胞核的荧光测定，在通道二中以激发波长495nm和发射波长519nm进行γH2AX的荧光测定，以获得通道一所识别的有效细胞的有效细胞核内通道二所检测的平均荧光强度，由此表征γH2AX的含量；更优选地，在两个通道中，测量倍数为200倍，每孔分析和测定9个视野。根据本专利技术的具体实施方式，步骤4)采用高内涵细胞分析系统进行，例如购自ThermoScientific的型号为ArrayScanVTI600的高内涵细胞分析系统。任选地，本专利技术的方法还包括，设置在步骤3-3)中没有加入一抗、仅在步骤3-4)中加入二抗的空白对照组，从而在步骤4)中得到由非特异吸附引起的空白信号，由此从检测到的荧光测定信号中扣除空白信号。本专利技术的方法还可包括剂量-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中设置多种包含不同浓度的亚硝胺或亚硝胺代谢物的细胞染毒液，进行所述方法，最后根据γH2AX的平均荧光强度和亚硝胺或亚硝胺代谢物的浓度绘制剂量-效应曲线。或者，本专利技术的方法还可包括时间-效应曲线的绘制。即，通过在步骤2)中将细胞在包含相同浓度的亚硝胺或亚硝胺代谢物的细胞染毒液中培养不同时间，进行所述方法，最后根据γH2AX的平均荧光强度和培养时间绘制时间-效应曲线。根据本专利技术的具体实施方式，当细胞为人肺癌细胞株A549时，可以如下进行本专利技术的方法：1)细胞培养：采用含10％FBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含亚硝胺或亚硝胺代谢物和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。

【技术特征摘要】
1.一种基于高内涵技术定量分析亚硝胺或亚硝胺代谢物致细胞DNA损伤的方法，所述方法包括以下步骤：1)细胞培养：将细胞接种在细胞培养液中进行细胞培养；2)细胞染毒：吸弃所述细胞培养液，加入细胞染毒液继续培养，所述细胞染毒液包含亚硝胺或亚硝胺代谢物和细胞培养液；3)免疫荧光标记：吸弃所述细胞染毒液，进行细胞中γH2AX的免疫荧光标记与细胞核的DAPI染色；4)高内涵技术定量分析：分别进行所述细胞的细胞核和γH2AX的荧光测定，以所识别的有效细胞的有效细胞核内检测到的平均荧光强度来表征γH2AX的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞为贴壁生长细胞；优选地，接种时，所述细胞处于对数生长期，以单细胞悬液接种于细胞培养液中；更优选地，细胞接种后将细胞在细胞培养液中于37℃，5％CO2条件下培养24h。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述亚硝胺为含有亚硝基的化合物，所述亚硝胺代谢物为亚硝胺的羧酸盐类代谢物，优选乙酸盐代谢物；优选地，所述亚硝胺为NNN或NNK；优选地，所述亚硝胺代谢物为NNN或NNK的羧酸盐代谢物，例如NNN-乙酸盐或NNK-乙酸盐；优选地，所述细胞染毒液中亚硝胺的浓度为0-500μg/mL，优选>0且≤500μg/mL，更优选为15.63-500μg/mL；或者，所述细胞染毒液中亚硝胺代谢物的浓度为0-235.24μg/mL，优选>0且≤235.24μg/mL，更优选为0.92-235.24μg/mL；或者，所述细胞染毒液中亚硝胺代谢物的浓度为0-132.64μg/mL，优选>0且≤132.64μg/mL，更优选为0.52-132.64μg/mL；优选地，在所述细胞染毒液中培养细胞1-24h、优选24h。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：3...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯宏卫，张森，胡清源，陈欢，王安，刘勇，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41