一种c‑Met表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种c‑Met表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该c‑Met表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如肝癌的癌症的药物中。

A C Met epitope peptide and its application

The invention discloses a C Met epitope peptide, its amino acid sequence containing the amino acid sequence of SEQ ID No.2 or SEQ ID No.3 shown, or contains an amino acid sequence shown in SEQ ID or SEQ No.2 ID No.3 add, deletion or substitution of one or more amino acids the formation of amino acid sequence. The C Met epitope peptide can be used to produce the main antigen-presenting cells, tissue compatibility antigen complex or cytotoxic T lymphocytes induced by agents, drugs can be used in the preparation of cancer treatment such as liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种c-Met表位肽及其应用
本专利技术属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性c-Met蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位肽及其应用。
技术介绍
肝细胞肝癌(以下简称“肝癌”)是恶性程度高、预后差的消化道恶性肿瘤，在世界范围内居癌症发病率的第六位，在癌症引起的死亡中位于第二位。它本质上是一种多基因异常疾病，涉及癌基因的过表达和抑癌基因的突变、缺失，从而使肿瘤细胞逃避了正常生长调控机制，自主进行增殖和侵袭。虽然近年来传统治疗方法(包括手术、化疗和靶向药物治疗)有所改善，但其预后差，肝癌的复发率和转移率仍居高位，肝癌患者的总生存率仍不理想。目前认为这些患者复发的根源是因为体内存在微小残留病灶，因此，需要寻求一种有效的方法，使得接受根治治疗或放化疗后患者体内的微小残留病灶能被有效清除。免疫治疗就是一种非常合适的选择。有学者用独特型抗原给肝癌患者接种以进行免疫治疗，但是这种治疗疗效让人失望，一部分原因被归咎于这种独特型抗原的免疫原性不够强。因此，我们迫切的需要发现一种大部分患者共有的新型的肿瘤抗原来改善免疫治疗对肝癌的疗效。理想的肿瘤抗原应该在不同起源的肿瘤细胞表面表达，在正常组织中低表达或者不表达，而且在肿瘤细胞的生长及生存中不可或缺，这样肿瘤细胞才不可能通过不表达或者下调表达该抗原以逃避免疫攻击。细胞毒性T细胞可以通过细胞表面表达的MHCI类分子识别肽段，从而与靶细胞结合达到杀伤靶细胞的目的。MHCI类分子及抗原特异性肽段决定了CTL细胞杀伤靶细胞时的MHC限制性和抗原特异性。中国汉族人群MHCI类分子HLAA位点0201表达率超过50％，故选择这一MHCI类分子广泛表达的位点研究CTL细胞抗原特异性。因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性c-Met蛋白细胞毒性T淋巴细胞识别的表位肽。
技术实现思路
有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本专利技术提供了一种c-Met表位肽及其应用。本专利技术的第一方面提供了一种c-Met表位肽，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。进一步地，上述c-Met表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。本专利技术的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述c-Met表位肽的氨基酸序列。本专利技术的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述c-Met表位肽。本专利技术的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述c-Met表位肽。本专利技术的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：1)如上所述的c-Met表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。本专利技术的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：1)如上所述的c-Met表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。进一步地，上述癌症为肝癌。本专利技术还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。优选地，癌症为肝癌。免疫治疗一直是医学领域研究的热点，众多研究者寻找到许多肿瘤的治疗靶点，比如肝癌中的EBV-C-MET和LMP2a等，但这些靶点都有各自的局限性，这就需要我们不断寻找新的肝癌治疗靶点，以最终达到个体化治疗的目的：对于每位患者检测其体内各种肿瘤抗原的表达情况，根据其强弱选择合适的靶点，以达到最佳的治疗效果，这种个体化的有差异的治疗也许是今后肿瘤免疫治疗的发展方向。c-Met，又名肝细胞生长因子受体，是一种由MET基因编码的具有酪氨酸激酶活性的蛋白质。c-Met的磷酸化激活，可以引起其下游通路靶点的活化，如PI3K/Akt和MAPK/Erk通路。通过激活这些通路，c-Met参与了包括细胞增殖、凋亡、骨架重排、分化等进程。在恶性肿瘤中，c-Met可以促进肿瘤细胞的增殖与转移。c-Met与多种恶性肿瘤的不良预后有关，可以作为这些肿瘤的治疗靶点，包括肺癌、胃癌、淋巴瘤等。在肝癌中，c-Met的表达水平比癌旁组织的显著增高，与肝癌的增殖和转移密切相关。通过使用c-Met抑制剂或RNA干扰技术，使得c-Met的表达下调，可以在体内外观察到肝癌的增殖和转移能力显著下降。推测在肝癌中广泛表达的c-Met蛋白，实际在肿瘤特别是肝癌细胞中起到抗凋亡分子的作用，c-Met蛋白也是一种理想的恶性肿瘤包括肝癌的免疫治疗直接靶点。本专利技术通过在线筛选获得两条高积分肽段aa1211和aa948，然后通过T2细胞亲和性和稳定性实验进一步筛选出具备高亲和力及稳定性的肽段aa1211。合成该他气短的五聚体后分别在健康供者及患者外周血中检测到不同水平的c-Met-CTL，证明该表位肽是在生理及病理情况下自然存在的，为后续实验的进行提供了必要条件。通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，运用CTL细胞的特性，将能通过作用于c-Met蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性。建立了来自于健康供者的c-Met蛋白特异性细胞毒性T细胞，这些细胞毒性T细胞能否有效地杀伤肝癌细胞，并且对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在c-Met-CTL细胞下调了肿瘤细胞c-Met表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。附图说明图1是本专利技术一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIVpol，aa1211和aa948为两条预测的肽段。图2是本专利技术一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。图3是本专利技术一个实施例的c-Met-CTL细胞表型测定结果图。图4是本专利技术一个实施例的c-Met-CTL增殖实验结果图。图5是本专利技术一个实施例的c-Met-CTL杀伤实验结果图。图6是本专利技术一个实施例的c-Met-CTL细胞功能实验结果图。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本专利技术的保护范围。以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。流式细胞仪购自BECKMANCOULTER，型号为Navios。T2细胞购自ADCC。FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种c‑Met表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA‑A0201分子形成复合物而被HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种c-Met表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。2.如权利要求1所述的c-Met表位肽，其特征在于，所述c-Met表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的c-Met表位肽的氨基酸序列。4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲以权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：江雪梅，熊炬，黄晓曦，陈正义，
申请(专利权)人：海口市人民医院，
类型：发明
国别省市：海南,46