本发明专利技术公开了一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用，属于生物领域。该厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16的保藏号为CGMCC NO:13391。该共培养物以玉米秸秆为底物产生的发酵液应用于荷斯坦奶牛的玉米秸秆粗饲料提高了奶牛粗饲料的消化率，同时减少了甲烷的排放量。
Co culture of anaerobic fungi and methane bacteria and application in natural enzymes for feeding cows
The invention discloses a co culture of anaerobic fungi and methane bacteria and its application in the feeding of natural enzymes in milk cows, belonging to the biological field. The anaerobic fungi (Neocallimastix frontalis) and methane bacteria (Methanobrevibacter ruminantium) Co cultures of Yak 16 the preservation number is CGMCC NO:13391. The fermentation liquid produced by using corn straw as the substrate of the common culture is applied to the corn stalk crude feed of Holstein cows, thereby improving the digestibility of the crude fodder of the cows and reducing the amount of methane emission.
【技术实现步骤摘要】
一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物及在奶牛饲用天然酶中的应用。
技术介绍
目前工业上所用的酶制剂微生物真菌菌种主要是里氏木霉、绿色木霉、瑞士木霉、米曲霉、黑曲霉、啤酒酵母菌株，其应用效果已得到公认，酶制剂符合“循环经济”、“低碳经济”、“绿色经济”等现代社会发展趋势，也被公认为目前唯一能够同时有效解决养殖领域中饲料安全、饲料原料缺乏和养殖污染等三大问题的饲料添加剂。随着酶制剂的应用效果不断显现，今后对酶制剂的需求将不断增加。扩大酶的来源，加强高效菌种选育研究仍然是纤维素酶研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种厌氧真菌和甲烷菌的共培养物本专利技术的另一个目的是提供上述菌在奶牛饲用天然酶中的应用。本专利技术技术方案如下：一种厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak16,CGMCCNO:13391。上述厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，方法为选择装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛，把厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物，从20mL亨氏厌氧管进一步扩大培养到100mL厌氧瓶后，每1次接种5mL菌液到45mL液体培养基中，得菌体及其所产的发酵液。优选的，液体培养基分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物。优选的，每次饲喂奶牛时，从奶牛瘤胃瘘管加入900mL包括高效厌氧真菌和甲烷菌共培养物的菌体及其所产的发酵液。本专利技术厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak16,CGMCCNO:13391，已经于2016年12月23日在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。研究表明甲烷菌利用厌氧真菌产生的甲酸、氢气和二氧化碳生成甲烷，使厌氧真菌和甲烷菌共培养物的最终代谢产物转变成甲烷、更多乙酸和ATP。同时厌氧真菌及甲烷菌共培养物普遍比厌氧真菌纯培养生长更稳定，厌氧真菌及甲烷菌共培养物比厌氧真菌纯培养普遍具有更高的木质纤维素降解酶活性和更强的降解木质纤维素的能力。自然的厌氧真菌及甲烷菌的共培养物能够反映瘤胃内真实的厌氧真菌和甲烷菌的共存关系，瘤胃内自然共培养物由于经过长期的自然选择和进化，可能比人工混合培养的共培养具有更强大的降解木质纤维素的能力。长期放牧饲养的牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物可能分泌更高的多糖水解酶和酯酶降解野生牧草和冷季干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离厌氧真菌及甲烷菌共培养物应用于提高粗饲料利用率，以及利用厌氧真菌及甲烷菌共培养物降解廉价木质纤维素底物生产高活性木聚糖酶、酯酶、甲烷和乙酸在工业应用方面具有重大意义。国内外在牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的选育鉴定及其对秸秆消化代谢特性和降解功效研究方面仍然是空白，从牦牛瘤胃中筛选具有良好降解木质纤维素效果的厌氧真菌和甲烷菌共培养菌株的高效组合，以期得到降解秸秆木质纤维素的天然高效酶，应用于反刍动物的秸秆粗饲料，提高反刍动物的秸秆粗饲料消化率，提高动物生产性能，同时利用厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解廉价木质纤维素底物发酵生产高活性木聚糖酶、酯酶、甲烷和乙酸等具有广阔工业发展前景和重要的社会意义。青藏高原牦牛终年以放牧方式生活在海拔3000米以上的极端生态环境，栖息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然发酵罐。其中，厌氧真菌是一种重要的木质纤维素降解微生物。有研究认为，与瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能够提高厌氧真菌纤维素降解活性，并促进木质纤维素降解代谢转化生成乙酸和甲烷。为开发利用瘤胃高效降解木质纤维素的优质真菌资源，本专利技术实验从青藏高原天祝放牧牦牛瘤胃食糜液中分离获得生长稳定的厌氧真菌及甲烷菌共培养物，并从中筛选出各属真菌及甲烷菌共培养物的高效木质纤维素降解共培养物，将厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak16以玉米秸秆为底物产生的发酵液应用于荷斯坦奶牛的玉米秸秆粗饲料提高了奶牛粗饲料的消化率，同时减少了甲烷的排放量。具体实施方式下面对本专利技术做进一步详细的说明。1.牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离和鉴定1.1材料1.1.1采样地点概况与牦牛瘤胃液的采集研究地点位于甘肃省天祝藏族自治县乌鞘岭牧场(102°47′13″E，37°10′37″N)，年均温-1-1.3℃，最高气温26℃，最低气温-30℃，年降水量265-632mm，海拔3100-3400m，属寒冷高原气候类型，温度变化剧烈，日照强，雨量充沛，高寒草甸是主要草地类型。野生牧草包括羊茅、苔草、早熟禾、嵩草、藏嵩草、细叶嵩草、棘豆、金露梅、珠芽寥，珠芽蓼(Polygonumviviparum)和线叶嵩草(Kobresiacapillifolia)是该地区的主要优势物种。2012年春季3月以采食天然牧草，无补饲的全放牧天祝白牦牛中的20头健康公牦牛(阉牛，年龄4-5岁，体重250±50kg)为实验动物。用不锈钢胃管一头通过开口器插入瘤胃，另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出，迅速用无菌注射器分别吸取1mL瘤胃食糜液接种到9mL厌氧真菌液体培养基中，并置39℃恒温培养。1.1.2厌氧真菌培养基基本培养基：参考Bauchop(1979)培养基做改进。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II165mL，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液I包括NaCl6g，(NH4)2SO43g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O0.4g，MgSO4·2H2O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。盐溶液II包括4gK2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。分离纯化培养基：在液体基本厌氧培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆。琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L琼脂粉，传代培养基：在液体基本培养基中添加1％(w/v)的小麦秸秆。培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO2。每管抽气充气3次，其中第一次约15min，其余二次每次5min，最后一次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，并于121℃高温高压湿热灭菌20min备用。复合抗生素：医用青霉素钠0.48g(80万单位)与医用硫酸链霉素1g(100万单位)溶解于5mL液体培养基中，使得青霉素和硫酸链霉素的终浓度分别达到1600IU/mL和2000IU/mL。(复合抗生素用来消除相细菌污染)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter ruminantium)的共培养物Yak 16,CGMCC NO:13391。
【技术特征摘要】
1.一种厌氧真菌(Neocallimastixfrontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacterruminantium)的共培养物Yak16,CGMCCNO:13391。2.权利要求1所述的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物在奶牛饲用天然酶中的应用，其特征在于：选择装有永久瘤胃瘘管成年荷斯坦奶牛，把厌氧真菌和甲烷菌的共培养物，从20mL亨氏厌氧管进一步扩大培养到100mL厌氧瓶后，每...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏亚琴，王治业，
申请(专利权)人：甘肃省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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