本发明专利技术公开了提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套试剂。本发明专利技术所提供的方法，包括下述步骤S1)和S2)：S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中的杂质，得到所述微生物；S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA；所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为9.0g/L氯化钠、0.12g/L氯化钾、0.24g/L氯化钙、0.2g/L碳酸氢钠和0.15g/L磷酸二氢钾。实验证明，本发明专利技术的提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及其成套试剂可以用来提取不同木质纤维素厌氧发酵物料的微生物DNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA的方法及 其成套试剂。
技术介绍
厌氧发酵产甲烷过程的本质是由多个微生物群协同作用将复杂的木质纤维素不 断分解直至生产甲烷和二氧化碳。近年来，随着天然气能源短缺和雾霾污染的日益加剧，生 物天然气（甲烷含量大于95%的沼气）的低成本、清洁环保、可持续性等优点逐渐显现，木 质纤维素物料产甲烷工艺开始向规模化、产业化和工业化方向发展。定性和定量认识厌氧 发酵过程中各功能微生物群的多样性和生长繁殖规律对于优化发酵工艺、提高产甲烷效率 具有重要意义。DGGE、Q-PCR、高通量测序等分子生物学技术为准确获知发酵物料中各类微 生物群的生长动态提供了理想途径，而发酵物料微生物群落总DNA的提取质量会直接关系 到后续分子生物学技术分析结果的客观性和准确性。 目前厌氧发酵物料中微生物总DNA提取方法有SDS(十二烷基磺酸钠）法、 CTAB (十六烷基三甲基溴化铵）法、SDS-CTAB结合法以及各生物技术公司推出的功能性试 剂盒法。传统的SDS法、CTAB法和SDS-CTAB结合法尽管所提取的总DNA质量和纯度均较高， 但难以有效获取吸附在木质纤维素表面的微生物DNA，导致部分关键微生物群信息的缺失， 且一次性提取的样本数量少。土壤、淤泥、粪便等功能性试剂盒法由于专一性强、快速便捷、 一次提取样本量大等优点，但对于腐殖酸和杂蛋白含量较高的木质纤维素厌氧发酵物料而 言，该方法的除杂能力有限，所提取的微生物总DNA纯度较差；另外，该方法一次提取总DNA 所需的样品质量很少（0.3-0. 5g)，所提取的微生物总DNA浓度也较低。目前大多数方法都 难以针对木质纤维素物料获得纯度和浓度均较高的微生物总DNA，急需一种针对木质纤维 素厌氧发酵物料的微生物DNA提取的成熟方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提取木质纤维素厌氧发酵物料微生物DNA。 为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了提取发酵物料中的微生物DNA的方法。 本专利技术所提供的提取发酵物料中的微生物DNA的方法，包括下述步骤S1)和S2): S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中 的杂质，得到所述微生物； S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA ; 所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为8-10g/L 氯化钠、0. lg-〇. 2/L氯化钾、0. 2-0. 3g/L氯化钙、0. lg-0. 3/L碳酸氢钠和0. 1-0. 2g/L磷酸 二氢钾。所述8-10g/L氯化钠具体可为9. Og/L氯化钠。所述0. lg-0. 2/L氯化钾具体可为 0. 12g/L氯化钾。所述0. 2-0. 3g/L氯化钙具体可为0. 24g/L氯化钙。所述0. lg-0. 3/L碳 酸氢钠具体可为0. 2g/L碳酸氢钠。所述0. l-o. 2g/L磷酸二氢钾具体可为0. 15g/L磷酸二 氢钾。 上述方法中，所述洗脱液的体积为所述物料体积的2-3倍。所述2-3倍具体可为 3倍。 上述方法中，所述除去所述微生物洗脱液中的杂质包括以下步骤：将所述微生物 洗脱液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A1 ;向所述沉淀A1 中加入稳定剂，得到微生物-稳定剂混合液；除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质，得 到所述微生物； 所述稳定剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为 5-7mMTris-HCl和2-4mM乙二胺四乙酸，所述稳定剂的pH为7. 5-8. 5。所述5-7mM Tris-HCl 具体可为6mM Tris-HCl。所述2_4mM乙二胺四乙酸具体可为3mM乙二胺四乙酸。所述pH 具体可为8. 0。 上述方法中，所述稳定剂的体积为所述沉淀A1体积的2-3倍。所述2-3倍具体可 为3倍。 上述方法中，所述除去所述微生物-稳定剂混合液中的杂质包括以下步骤：将所 述微生物-稳定剂混合液进行离心，使微生物进入沉淀中，收集沉淀，将该沉淀命名为沉淀A2 ;向所述沉淀A2中加入洗涤液，得到微生物-洗涤液混合液；除去所述微生物-洗涤液混 合液中的杂质，得到所述微生物； 所述洗涤液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为50-70mM Tris-HCl、10-20mM EDTA、5. 5-6. Og/L NaCl 和 10-20g/L PVP-40,所述洗涤液的 pH 为 7. 5-8. 5。所述 50-70mM Tris-HCl 具体可为 60mM Tris-HCl。所述 10-20mM EDTA 具体可为 15mM EDTA。所述 5. 5-6. Og/L NaCl 具体可为 5. 8g/L NaCl。所述 10-20g/LPVP-40 具体可 为15g/L PVP-40。所述pH具体可为8.0。 上述方法中，所述洗涤液的体积为所述沉淀A2体积的2-3倍。所述2-3倍具体可 为3倍。 上述方法中，所述S2)包括向所述微生物中加入成套裂解试剂，得到微生物裂解 液；除去所述微生物裂解液中的杂质，得到所述微生物DNA ; 所述成套裂解试剂由SDS裂解液、蛋白酶K、溶菌酶、纤维素酶、木聚糖酶和 GuSCN溶液组成；所述SDS裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分别为90-110mM Tris-HCl、30-50mM EDTA、7-7.5g/500mL NaCl、15-25g/500mL SDS和5-15g/500mL PVP-40， 所述SDS裂解液的pH为7. 5-8. 5 ;所述GuSCN溶液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度分 别为 90-110mM Tris-HCl 和 55-65g/100mL 异硫氰酸胍，所述 GuSCN 溶液的 pH 为 6. 0-6. 5。所述 90-110mMTris-HCl具体可为lOOmMTris-HCl。所述 30-50mM EDTA 具体可 为 40mM EDTA。所述 7-7.5g/500mLNaCl具体可为 7.305g/500mLNaCl。所述 15-25g/500mL SDS 具体可为 20g/500mL SDS。所述 5-15g/500mL PVP-40 具体可为 10g/500mL PVP-40。所 述55-65g/100mL异硫氰酸胍具体可为59. 08g/100mL异硫氰酸胍。所述SDS裂解液的pH 具体可为8. 0。所述GuSCN溶液的pH具体可为6. 2-6. 4,如6. 3。 上述方法中，所述SDS裂解液的体积为所述微生物体积的1-2倍。所述1-2倍具 体可为2倍。所述成套裂解试剂中，所述蛋白酶K、所述溶菌酶、所述纤维素酶、所述木聚糖 酶和所述GuSCN溶液的比例可为3U:5mg:0. 045U:0. 0375U:200 y L。 上述方法中，所述稳定剂、所述洗涤液、所述SDS裂解液和所述GuSCN溶液均为无 菌溶液。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了提取微生物DNA的成套试剂。 本专利技术所提供的提取微生物DNA的成套试剂，包括所述成套裂解试剂、所述洗脱 液、所述稳定剂和所述洗涤液这四种试剂中的四种、任三种或任两种。 上述成套试剂中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
提取发酵物料中的微生物DNA的方法，包括下述步骤S1)和S2)：S1)用洗脱液洗下物料上的微生物，得到微生物洗脱液，除去所述微生物洗脱液中的杂质，得到所述微生物；S2)提取所述微生物的DNA得到所述微生物DNA；所述洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为8‑10g/L氯化钠、0.1g‑0.2/L氯化钾、0.2‑0.3g/L氯化钙、0.1g‑0.3/L碳酸氢钠和0.1‑0.2g/L磷酸二氢钾。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马旭光，袁旭峰，敦越，江滔，
申请(专利权)人：乐山师范学院，
类型：发明
国别省市：四川;51
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