一株产bostrycin的蕲艾内生真菌HCH285制造技术

本发明专利技术属于药用植物和农业微生物技术领域。具体涉及一株产bostrycin的蕲艾内生真菌HCH285及应用，本发明专利技术分离的内生真菌HCH285经分子生物学和形态学鉴定为黑孢霉属球黑孢菌（

A strain of Bostrycin producing endophytic fungi HCH285 Qiai

The invention belongs to the technical field of medicinal plants and agricultural microorganisms. In particular to a Bostrycin producing strains of Artemisia argyi endophytic fungi HCH285 and application, the invention of the endophytic fungi isolated HCH285 by molecular biological and morphological identification of Nigrospora genus Nigrospora sphaerica Mason (

【技术实现步骤摘要】
一株产bostrycin的蕲艾内生真菌HCH285
本专利技术属于药用植物和农业微生物
，具体涉及从药用植物蕲艾(ArtemisiaargyiLevl.etVan.var.argyicv.Qiai)中分离一株内生真菌，该菌株为黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)，它能产生具抗癌活性的卷线孢菌素(bostrycin)，可用于规模化批量生产卷线孢菌素。
技术介绍
肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。目前，癌症已经成了当今社会危害人类身体健康的严重疾病，20世纪70年代初，我国癌症发病人数约为90万，死亡约70万人；2005年，癌症发病人数约180万-200万，死亡140万至150万。所有的恶性肿瘤中以肺癌的上升趋势最快，2000年至2005年，我国肺癌发病人数增加了11.6万人，死亡人数增加了10.1万人。(张晓怡.基于人群监测资料的恶性肿瘤危险因素研究[D].浙江大学,2013)。2012年新发恶性肿瘤病例约358.6万例，死亡病例218.7万例。全国恶性肿瘤发病率为264.85/10万(男性289.30/10万，女性239.15/10万)，(陈万青,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2016,(01):1-8)。而全球的癌症发病率也呈增长趋势，在1991年到2000年间，全球癌症发病及死亡人数均增长22％，2000年，全球新发癌症人数超过1000万。世界卫生组织预测，到2020年，每年新发癌症病人数将达到1500万，癌症已经成为新世纪人类的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题，所以肿瘤防治显得愈加重要和迫切。据文献报道，蒽醌类化合物bostrycin(卷线孢菌素)能够抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长(陈冬妮等,陆勇军.bostrycin通过抑制PTP1B酶活性诱导乳腺癌细胞的凋亡[A].中国化学会.第八届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C].中国化学会:,2013:1.),因此bostrycin可作为天然的抗肿瘤潜在药物开发。
技术实现思路
本专利技术在于提供从蕲艾中分离得到的一株内生真菌HCH285，其代谢产物bostrycin可用于抑制肿瘤细胞，所述内生真菌为球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285，保藏编号为：CCTCCNO：M2017061；本专利技术在于通过黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285以液体发酵方法高效制备bostrycin的应用；本专利技术在于提供了黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285的发酵方法，利用该方法可规模化批量生产bostrycin，采用液体发酵的bostrycin含量可达729mg/L。为达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285的获得：申请人自菊科植物蕲艾活体植株茎段中分离得到蕲艾内生真菌HCH285，经18SrDNA鉴定和微生物学鉴定证明该菌株属于黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)。本专利技术所述的黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285菌株的分离、筛选及鉴定流程见实施例1。HCH285发酵液和菌丝中的代谢产物bostrycin的提取见实施例2，进行分离纯化以及经过质谱和核磁共振图谱解析，结果表明该物质为bostrycin。菌株分类学地位的鉴定：1.固体培养特征：采用MYA培养基(成分：麦芽浸膏20g，，酵母浸膏5g,琼脂15g，加水定容至1L，培养黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285菌株。菌落形态：24℃培养4d，菌落直径为45mm，8d时基本长满整个培养皿，菌落为圆形，前期为白色，后变为红色；菌落绒毛状，生长稍微蓬松，菌落边缘相对整齐，菌落背面可见红色，外缘呈圆点。菌丝形态：无色有隔菌丝。产孢特征：，分生孢子，单个产生，球形或椭圆形，黑色、光滑、无隔、单孢。2.ITS序列测定：1)提取菌丝体总DNA。2)以ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3’)为引物，扩增出18SrDNA序列，测序。3)将测序结果递交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast进行序列比对，根据BLAST结果并结合其形态学特征得出结论，证明该分离的菌株属于黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)。所述的菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285，保藏编号为CCTCCNO：M2017061，地址：中国武汉武汉大学。黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285在制备bostrycin中的应用，所述的应用包括下述步骤：球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285按1％～3％接种量接种于发酵培养基中，发酵温度22-26℃，pH5.0-7.0，DO值50％-70％，转速50-200rpm，发酵周期48-96h，放罐；所述的发酵培养基为PDB液体培养基或PSB液体培养基。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术所述对象属于微生物领域，具有生长繁殖迅速，不受季节、气候和地域限制，产量提升空间大等优点。2.本专利技术提供天然的抗肿瘤潜在药物活性物质，能有效减少化学合成药物的副作用。3.本专利技术首次提出了黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)可用于生产bostrycin。4.本专利技术提供的黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285的bostrycin产量高，适用于bostrycin的工业化生产。摇瓶发酵中每升发酵液中bostrycin的产量为650-729mg/L，大型发酵每升发酵液中bostrycin的产量达到400-605mg/L。附图说明图1为黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285的ITSPCR产物电泳图。图2为黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285在PDA培养基上的菌落形态。图3为黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285在显微镜下的孢子形态。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，均来源于商业渠道。实施例1：黑孢霉属球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285的获得及鉴定：1从中国湖北省蕲春县采集蕲艾(ArtemisiaargyiLevl.etVan.var.argyicv.Qiai)野生植株；2挑选健康的植株短截茎段成10cm,流水冲洗30min，除去表面污垢；3表面消毒，步骤如下：1)先用70％-75％酒精浸泡2次，每次2-3min；2)接着用0.1％HgCl2浸泡5min，轻摇3次；3)沥干植株上的液体，再用无菌水浸洗5遍，充分洗净以避免HgCl2残留，并用最后一次浸洗液涂布于含有PDA培养基(按常规方法，成分：土豆200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蕲艾内生真菌，其特征在于，所述的蕲艾内生真菌为球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)HCH285，保藏编号为：CCTCC NO：M2017061。

【技术特征摘要】
1.一种蕲艾内生真菌，其特征在于，所述的蕲艾内生真菌为球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285，保藏编号为：CCTCCNO：M2017061。2.权利要求1所述的蕲艾内生真菌在制备卷线孢菌素(bostrycin)中的应用。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王沫，高超，王璋倩，揭晶，韩婷，肖飞雄，杨倩，石乐，
申请(专利权)人：湖北省荆楚药材研究院，
类型：发明
国别省市：湖北,42