一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法技术

本发明专利技术提供了一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法，包括：(1)固体产物原料的获得：将HCH285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料；或将HCH285液体发酵方法所得的发酵液经喷雾干燥后收集得到的固体粉末粉碎过筛即得固体产物原料；(2)提取分离：将所得固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400g/mL；所述发酵液制得的固体产物原料使用70％～95％的甲醇超声提取时将pH调至1.5～2.5。该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且bostrycin的得率高。

A method for extraction and separation of bostricin from solid products fermented by hch285

【技术实现步骤摘要】
一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法
本专利技术涉及bostrycin(卷线孢菌素)制备方法领域，特别涉及一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法。
技术介绍
醌类化合物bostrycin是一种天然色素产物，最先在1968年由NodaT发现(Nodaetal1968&1970)。据文献报道，bostrycin能够抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长(Chenetal2011，Chenetal2012，陈冬妮2013)，且对卡介苗、结核分枝杆菌均有抑制作用，尤其对多种药物有耐性的结核分枝杆菌有较好活性(黄宇虹2011)。虽然bostrycin在抗菌、抗肿瘤等多方面表现出较大优势，但工业合成困难，产量较少，对其深入研究存在局限。而微生物资源丰富，培养成本低廉。利用微生物发酵生产药物具有生产周期短、产量高等优点。所以，从药用植物分离获得产bostrycin的微生物，经发酵后从产物中提取bostrycin，将可以大大提高其产量，具有极大的研究意义。国内外已有从植物中分离得到产bostrycin内生菌的报道(Xuetal2010，Xiaetal2011，Charudattanetal1982)，但多集中于液体发酵研究，所得产物通常经乙酸乙酯多次萃取后浓缩，再用硅胶柱进行色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集一定浓度乙酸乙酯/石油醚的洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶得红色颗粒状晶体化合物bostrycin。此方法主要适用于从发酵液中提取分离bostrycin。但大量发酵液不易长期存放，且bostrycin易受温度、光照等影响从而发生性质的改变。本专利技术人所在的课题组之前筛选到了一株产bostrycin的蕲艾内生菌HCH285，专利号为“201710183008.X”，所述的菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)HCH285，保藏编号为CCTCCNO：M2017061，地址：中国武汉武汉大学。如何开发一种以固体发酵方法所得发酵产物和发酵液经喷雾干燥后所得固体产物为原料，提取分离醌类化合物bostrycin的方法，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种提取分离醌类化合物bostrycin的方法，该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且bostrycin的得率高。本专利技术这样实现：本专利技术提供一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1、固体产物原料的获得：将HCH285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料；或将HCH285液体发酵方法所得的发酵液经喷雾干燥后收集得到的固体粉末粉碎过筛即得固体产物原料；步骤2、提取分离：将步骤1所得的固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400(g/mL)；所述发酵液制得的固体产物原料使用70％～95％的甲醇超声提取时将pH调至1.5～2.5。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的一种提取分离醌类化合物bostrycin的方法，该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且提取bostrycin的得率高，纯度高，工艺简单。附图说明图1为HCH285固体发酵产物中bostrycin的高效液相分析图谱；图2为HCH285发酵液中bostrycin的高效液相分析图谱；图3为溶剂种类对固体发酵产物中bostrycin得率的影响；图4为溶剂百分数对固体发酵产物中bostrycin得率的影响；图5为料液比对固体发酵产物中bostrycin得率的影响。具体实施方式实施例1S1、固体产物原料的获得：将HCH285固体发酵工艺所得发酵产物于50℃干燥24h后粉碎，经过筛得60～80目粉末。S2、提取分离：称取0.50g上述粉末至锥形瓶中，加入80％的甲醇超声提取，以粉末质量为基础按体积计算，料液比为1：300g/mL，提取3次，超声时间50min，超声温度60℃，超声功率600W，超声频率45KHz。S3、纯化：提取液合并后浓缩至干，分次加入50mL5％碳酸钠溶液溶解，再过滤除去不溶性杂质，滤液用盐酸调pH至2.0，静置36h，抽滤，得红色晶体颗粒0.0806g。S4、含量测定：精密称取上述红色晶体颗粒10.0mg，至50mL容量瓶，加入色谱甲醇溶解并定容，得浓度为0.20mg/mL的溶液。取适量经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于样品瓶中，利用高效液相色谱分析，产品纯度为91.77％，得率14.79％。高效液相色谱图见图1。色谱条件为：SymmetryC18色谱柱，250×4.6mm，5μm；VWD-3100可变波长紫外可见光检测器；柱温30℃；进样量10μL；检测波长302nm；流动相为甲醇与缓冲液(35：65v/v)，均用0.45μm的滤膜过滤并脱气处理；缓冲液为取3mL色谱级甲酸，加水稀释至1000mL；流速1mL/min；运行时间30min。实施例2S1、固体产物原料的获得：将HCH285接种于PSB培养基，置于摇床中发酵培养。培养温度22～26℃，摇床转速100～300r/min培养时间2-5d，过滤除去菌丝，得含bostrycin的发酵液。取2000mL色素溶液，用喷雾干燥机制备得固体粉末61mg(紫红色)。喷雾干燥机的进风温度为130～180℃、进料速度为5～20r/min。S2、提取分离：精密称取上述固体粉末50mg，加入80％的酸性甲醇(pH2.11)超声提取，以粉末质量为基础按体积计算，料液比为1：300g/mL，提取3次，超声时间50min，超声温度60℃，超声功率600W，超声频率45KHz。本专利技术人意外发现发酵液喷雾干燥后的固体粉末可能物理性质发生改变，不溶于80％的甲醇，经过本专利技术人的大量创新性探索性试验发现pH调至1.5～2.5时，发酵液喷雾干燥后的固体粉末即可溶解；S3、纯化：提取液合并后浓缩至干，分次加入50mL5％碳酸钠溶液溶解，再过滤除去不溶性杂质，滤液用盐酸调pH至1.85，静置36h，抽滤，得红色晶体颗粒5.14mg。S4、含量测定：精密称取上述红色晶体颗粒5.0mg，至25mL容量瓶，加入色谱甲醇溶解并定容，得浓度为0.20mg/mL的溶液。取适量经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于样品瓶中，利用高效液相色谱分析，产品纯度为82.09％，得率25.74％(g/L)。高效液相色谱图见图2。色谱条件为：SymmetryC18色谱柱，250×4.6mm，5μm；VWD-3100可变波长紫外可见光检测器；柱温30℃；进样量10μL；检测波长302nm；流动相为甲醇与蒸馏水(35：65v/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n步骤1、固体产物原料的获得：将HCH285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料；或将HCH285液体发酵方法所得的发酵液经喷雾干燥后收集得到的固体粉末粉碎过筛即得固体产物原料；/n步骤2、提取分离：将步骤1所得的固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400g/mL；所述发酵液制得的固体产物原料使用70％～95％的甲醇超声提取时将pH调至1.5～2.5。/n

【技术特征摘要】
1.一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、固体产物原料的获得：将HCH285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料；或将HCH285液体发酵方法所得的发酵液经喷雾干燥后收集得到的固体粉末粉碎过筛即得固体产物原料；
步骤2、提取分离：将步骤1所得的固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400g/mL；所述发酵液制得的固体产物原料使用70％～95％的甲醇超声提取时将pH调至1.5～2.5。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中将HCH285固体发酵方法所得发酵产物于50℃干燥24h后粉碎经过筛得60～80目粉末，即得固体产物原料。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中将HCH285经液体发酵所得发酵液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王沫，揭晶，王璋倩，石乐，韩婷，
申请(专利权)人：湖北省荆楚药材研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42