一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的丁香酚人工抗原为将式I所示的丁香酚半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供丁香酚人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于丁香酚抗体的制备，以及丁香酚药物残留检测具有重大价值。

A eugenol hapten and artificial antigen and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种丁香酚人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
丁香酚为芳香油中提取得到的一种难溶于水的带有芳香气味的淡黄色液体，因其麻醉效果好和成本低且休药期短而作为鱼用麻醉剂被广泛运用到鲜活水产品的运输和保鲜上，但其残留具有肝脏毒性，可引起肠胃炎和厌食症，并具有潜在的致癌性等，威胁到动物生产，通过食物链进入人体后危害人们身体健康。丁香酚在水产品收贮运环节的广泛应用，使得建立一种高效灵敏的丁香酚药物残留分析方法成为日益迫切的需要。目前对于丁香酚的检测方法，主要有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱－质谱联用法和液相色谱－质谱联用法，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种丁香酚人工抗原及其制备方法与应用。本专利技术所提供的丁香酚人工抗原是在丁香酚半抗原的基础上构建所得的抗原。所述丁香酚半抗原属于本专利技术的保护范围，其结构如式I所示。式I本专利技术所提供的制备所述丁香酚半抗原的方法，具体可包括如下步骤：1、丁香酚溶解于甲苯中，再加入Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液反应，获得反应液。所述丁香酚、甲苯、Ph3P=CHCOOEt的配比为500mg：5ml：1045mg，所述加入反应时间为5个小时，所述反应温度为80℃。2、反应液降温旋干，残余物经复溶、洗涤、干燥获得中间体1，中间体1加入甲醇复溶残余物，再加入氢氧化钠反应，反应液经去甲醇、调pH、萃取、干燥、旋干获得丁香酚半抗原460mg。所述复溶液为5ml甲苯，所述洗涤液为碳酸钠溶液，所述干燥剂为2g无水硫酸钠，所述甲醇复溶残余物、氢氧化钠的配比为5ml：2ml，所述调pH为稀盐酸调pH=2-3，所述萃取液为15ml乙酸乙酯。在丁香酚半抗原的基础上构建所得的丁香酚抗原也属于本专利技术的保护范围。所述丁香酚抗原，为将所述丁香酚半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述丁香酚抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述丁香酚抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述丁香酚半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述丁香酚抗原。在本专利技术中，所述丁香酚抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将所述丁香酚半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述丁香酚半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为7.8mg：1.5ml：21.5mg：13mg。（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5ml；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5ml；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述丁香酚抗原。所述丁香酚半抗原（式I）或所述丁香酚抗原在定性或定量检测丁香酚中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述丁香酚抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。本专利技术所提供的丁香酚半抗原，以及所述丁香酚抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于丁香酚抗体的制备，以及丁香酚药物残留检测具有重大价值。附图说明图1为丁香酚的标准曲线。图2为ELISA法检测两种组织样本（鱼肉、虾肉）与HPLC检测结果一致性。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、丁香酚半抗原的制备50ml圆底烧瓶中加入5ml甲苯，加入丁香酚500mg（3.0mmol），室温搅拌使体系搅拌均匀，N2保护下，向体系中滴加Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液（1045mg溶解于5ml甲苯中），滴加完毕，升温到80℃反应5h，TLC监测丁香酚反应完全，将反应液降至室温后，将反应液旋干，残余物加入5ml甲苯复溶，0.1M碳酸钠溶液洗涤，分出有机相1g无水硫酸钠干燥，旋干中间体1，加入5ml甲醇复溶残余物，并加入2M氢氧化钠溶液2ml，室温反应过夜，TLC中间体1反应完全，减压除去甲醇，体系稀盐酸调PH=2-3，15ml乙酸乙酯萃取，有机相2g无水硫酸钠干燥，旋干得半抗原（式I）460mg。反应方程式如下：式I实施例2、丁香酚人工抗原的制备1、免疫原的合成（1）将7.8mg丁香酚半抗原用1.5mlDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取BSA50mg溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01MPBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。2、包被原的合成（1）将7.8mg丁香酚半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取OVA33.6mg溶于3.5ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物，其结构如式I所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种化合物，其结构如式I所示：



式I。


2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：
丁香酚溶解于甲苯中，再加入Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液反应，获得反应液；所述丁香酚、甲苯、Ph3P=CHCOOEt的配比为500mg：5ml：1045mg，所述加入反应时间为5个小时，所述反应温度为80℃；
反应液降温旋干，残余物经复溶、洗涤、干燥获得中间体1，中间体1加入甲醇复溶残余物，再加入氢氧化钠反应，反应液经去甲醇、调pH、萃取、干燥、旋干获得丁香酚半抗原460mg。


3.丁香酚抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。


4.根据权利要求3所述的丁香酚抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。


5.根据权利要求3或4所述的丁香酚抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述丁香酚抗原。


6.根据权利要求5所述的丁香酚抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）将所述丁香酚半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；
其中，所述丁香酚半抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，刘河冰，聂靖东，邢维维，贾良曦，李蓉蓉，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11