一种高纯度重楼皂苷VI的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种高纯度重楼皂苷Ⅵ的制备方法及应用，属于中草药提取分离领域。该方法的具体步骤为：将重楼或延龄草药材粗粉碎后，乙醇提取，提取液依次进行大孔吸附树脂、硅胶和反相材料柱层析，以乙酸乙酯、乙醇和水为洗脱剂，洗脱液回收溶剂后将沉淀部分过滤、水洗和干燥，即可得到高纯度的重楼皂苷Ⅵ。本发明专利技术具有操作步骤易于重复、条件易于控制、放大和溶剂毒性小、易回收等优点，所得重楼皂苷Ⅵ基本无有机溶剂残留，纯度达98%以上。终产品重楼皂苷Ⅵ经小鼠常压缺氧耐受性、颈总动脉结扎所致小鼠大脑缺血、缺血再灌注所致大鼠心肌损伤和大鼠离体心脏心肌缺血所致心肌梗死等影响的药效学研究，效果较好，可用于治疗心脑血管疾病产品开发。

Preparation and application of a high purity polyphyllins VI

Preparation and application of the invention relates to a high purity of Paris saponin, which belongs to the field of herbal extraction separation. The method comprises the following steps: Paris or Trillium medicine after coarse crushing, ethanol extraction, extraction by macroporous resin, silica gel column chromatography and reversed-phase materials, with ethyl acetate, ethanol and water as eluent, elution solvent recovery will precipitate filtering, washing and drying, can be obtained by polyphyllins high purity VI. The invention has the advantages of easy operation, easy control, repetitive amplification and solvent toxicity, easy recovery, income of Chonglou saponin basically no organic solvent residue, the purity is more than 98%. Effect of end products of Chonglou saponin by normobaric hypoxia tolerance, carotid artery ligation in mice induced by cerebral ischemia, ischemia reperfusion induced myocardial injury in rats and isolated rat heart myocardial ischemia induced myocardial infarction. The study, the effect is good, can be used for the treatment of heart cerebrovascular disease product development.

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度重楼皂苷VI的制备方法及应用
本专利技术涉及一种从重楼、延龄草或其它植株中提取、制备高纯度重楼皂苷VI的方法，所得样品可用于缺血性心脑血管疾病的治疗及预防。
技术介绍
重楼为百合科重楼属多年生草本植物，全世界共有27种，我国有25种，其中有19种分布于我国西南地区，多以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历年版中国药典收载，《中华人民共和国药典》2015年版收载重楼品种为七叶一枝花ParispolyphyllaSmithvar.chinensis(Franch.)Hara和云南重楼ParispolyphyllaSmithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.的干燥根茎。重楼性微寒，味苦，归肝经，有小毒。功效：消肿止痛，清热解毒，息风定惊，用于跌打损伤，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，惊风抽搐等症。重楼药材中主要含有甾体皂苷类化合物，目前已报道了近90个，根据结构类型主要分为偏诺甾体皂苷(pennogeninsaponins)和薯蓣甾体皂苷(diosgeninsaponins)，以及C-22内酯甾体皂苷、孕甾烷皂苷(pregnanesaponins)和呋甾烷型甾体皂苷(furostanolsaponins)等，大多数甾体皂苷具有较强的药理和生理活性，具有抗肿瘤、止血、抗菌、消炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化、保护肝脏与肾脏等功效，临床方面重楼皂苷广泛应用于治疗肿瘤、泌尿系统感染和妇科血症等各类疾病的治疗。近年来，许多学者对重楼皂苷的药理活性和临床应用进行深入而广泛的研究，为重楼皂苷的综合开发和利用开辟更广阔的前景，但由于重楼资源限制，影响了重楼皂苷的综合开发和利用。重楼皂苷VI是重楼皂苷的主要有效成分之一，也是重楼药材和含重楼药材制剂质量主要控制的有效成分之一，具有较好的止血和抗肿瘤活性，对妇科血症有较好的疗效，能有效地预防小鼠结肠炎癌变。研究发现重楼皂苷VI不仅存在于重楼属药材中，而且还存在于延龄草属等相关科属植物中，为重楼皂苷VI的分离、制备和深入研究、开发提供了基础。延龄草，别名头顶一颗珠、芋儿七、狮儿七，为百合科延龄草属植物延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)，含有重楼皂苷VI、延龄草苷等甾体皂苷类、黄酮苷类和苯丙素苷类等化合物。主要分布在我国湖北、西藏、云南、四川、陕西、甘肃、安徽、浙江(西北部目山)及福建武夷山等地，目前人工栽培已基本成功。重楼皂苷VI分离、制备，目前主要用于药材化学成分分离和鉴定。孙迪等人(七叶一枝花的化学成分研究[J].食品与药品，2016，18(2)：98-101.)、李慧敏等人(延龄草化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报，2013，30(7)：509-516.)、文彦诗等人(滇重楼须根中的化学成分[J].西部林业科学，2015，44(6)：51-55.)、刘杨等人(金线重楼的皂苷成分研究[J].中南药学，2015，15(1)：41-43.)，主要采用甲醇、乙醇等溶剂提取、正丁醇萃取，然后将萃取液进行硅胶柱层析、反相材料柱层析或通过半制备方法，以氯仿、甲醇或乙腈等溶剂为洗脱剂，最后通过多次甲醇结晶得到，所得最终产品易存在甲醇等有机溶剂残留。另外，由于氯仿、甲醇和乙腈溶剂毒性都比较大，易挥发，长时间使用对人体伤害也比较大，且对环境污染也比较严重，限制了其在工业上的大量使用，目前只是用于少量重楼皂苷VI样品制备，不适宜规模化生产、制备重楼皂苷VI。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从富含重楼皂苷VI(重楼皂苷VI含量大于0.1％)的重楼或其它植物中提取制备重楼皂苷VI的方法及应用。采用本专利技术制备重楼皂苷VI，主要使用溶剂为乙醇、乙酸乙酯和水，工艺简便可行，适用于工业化大生产，毒性小，且所用溶剂易回收、可反复使用，对环境污染较小，所得最终产物经水洗后基本不含有机溶剂残留。初步药效学研究表明，该成分对心脑血管疾病有较好的治疗作用，为下一步药物、功能食品的研发和应用奠定了基础。本专利技术涉及一种从富含重楼皂苷VI的重楼、延龄草或其它植株中提取制备高纯度重楼皂苷VI的方法及应用：1、一种高纯度重楼皂苷Ⅵ的制备方法，其特征在于以下步骤：1)重楼或延龄草干燥植株粗粉碎，用40％-95％乙醇溶液回流提取，料液比为1:10-1:50，提取次数1-4次，提取温度50-90℃，每次提取时间60-180min，提取液经过滤，合并真空浓缩成含醇量30％-50％溶液，过滤得上清液，备用，残渣弃去，主要除去小极性成分和油脂类化合物；2)步骤1)得到的上清液上大孔吸附树脂柱，先用2-4倍柱体积30％-50％乙醇洗，主要除去极性较大的甾体皂苷等成分，再用3-5倍柱体积70％-90％乙醇洗脱，将70％-90％乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷Ⅵ的粗提取物；3)步骤2)得到的样品，100目硅胶拌样后，上100-200目硅胶柱，进行硅胶柱层析，用3-5倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(25:1-5:1，W/W)洗脱溶剂洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷VI成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；4)步骤3)得到的样品用40％-60％乙醇溶解后上反相柱，先用2-4倍柱体积60％-70％乙醇洗脱，除去与重楼皂苷VI分子量相似和极性相近的成分，再用3-5倍柱体积75％-85％乙醇洗脱，取75％-85％洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷VI粗品；5)步骤4)析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1-2小时，即得所需重楼皂苷Ⅵ；6)步骤5)所得高纯度重楼皂苷VI样品采用HPLC检测纯度大于98％，水分小于2％。安全性评价将本专利技术所得重楼皂苷Ⅵ样品进行急性毒性试验研究，结果表明小鼠半数致死量小于2.19g/kg，为临床推荐使用剂量(2mg/kg)的1095倍，死亡及存活动物剖检，未见脏器异常变化。本专利技术得到的重楼皂苷Ⅵ样品安全性有保障。本专利技术所得重楼皂苷Ⅵ进行药效学研究1)小鼠常压缺氧耐受性研究采用小鼠常压缺氧耐受性实验对药物耐缺氧作用进行研究，结果表明重楼皂苷Ⅵ40mg/kg.bw、60mg/kg.bw剂量连续给药20d，可明显延长常压缺氧条件下小鼠的存活时间，延长率分别为72.85％、77.49％。与空白对照组比较，具有显著性差异，提示重楼皂苷Ⅵ具有增加心肌供氧量和提高心肌耐缺氧能力的作用。2)对颈总动脉结扎所致小鼠大脑缺血的影响采用颈总动脉结扎所致小鼠大脑缺血实验对药物抗脑缺血作用进行研究，结果表明重楼皂苷Ⅵ40mg/kg.bw连续给药30d，可明显延长结扎颈总动脉后小鼠的存活时间，延长率为184.76％，与空白对照组比较，具有显著性差异，提示重楼皂苷Ⅵ对急性脑缺血有一定保护作用。3)对缺血再灌注所致大鼠心肌损伤的影响在SD大鼠冠状动脉前降支结扎40分钟、再灌注2小时的心肌缺血试验中，十二指肠给予重楼皂苷Ⅵ20、40、60mg/kg，能明显减轻心肌梗死的程度，缩小梗死面积，减轻梗死区重量，使梗死区占心室及心脏百分比降低；低剂量还能使SOD值增加，但三剂量均对MDA、CK、LDH的水平无明显影响。结果提示重楼皂苷Ⅵ对心肌缺血再灌注损伤有明确保护作用。4)对大鼠离体心脏心肌缺血所致心肌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度重楼皂苷Ⅵ的制备方法，其特征在于以下步骤：1）重楼或延龄草干燥植株粉碎，用40%‑95%乙醇溶液回流提取，料液比为1:10‑1:50，提取次数1‑4次，提取温度50‑90℃，每次提取时间60‑180min，提取液经合并真空浓缩成含醇量30%‑50%溶液，过滤得上清液，备用；2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂柱，分别用2‑4倍柱体积30%‑50%乙醇、3‑5倍柱体积70%‑90%乙醇洗脱，将70%‑90%乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷Ⅵ粗提取物；3）步骤2）得到的样品，100目硅胶拌样后，上100‑200目硅胶柱，用3‑5倍柱体积乙酸乙酯‑乙醇洗脱，乙酸乙酯和乙醇重量比为25:1‑5:1，将含有重楼皂苷VI成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；4）步骤3）得到的样品用40%‑60%乙醇溶解后上反相柱，依次用2‑4倍柱体积60%‑70%乙醇、3‑5倍柱体积75%‑85%乙醇洗脱，取75%‑85%乙醇洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀；5）将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2‑3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1‑2小时，即得所需重楼皂苷Ⅵ；6）所得重楼皂苷Ⅵ样品经HPLC检测含量大于98%，安全、稳定，可用于缺血性心脑血管疾病的治疗。...

【技术特征摘要】
1.一种高纯度重楼皂苷Ⅵ的制备方法，其特征在于以下步骤：1）重楼或延龄草干燥植株粉碎，用40%-95%乙醇溶液回流提取，料液比为1:10-1:50，提取次数1-4次，提取温度50-90℃，每次提取时间60-180min，提取液经合并真空浓缩成含醇量30%-50%溶液，过滤得上清液，备用；2）步骤1）得到的上清液上大孔吸附树脂柱，分别用2-4倍柱体积30%-50%乙醇、3-5倍柱体积70%-90%乙醇洗脱，将70%-90%乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷Ⅵ粗提取物；3）步骤2）得到的样品，100目硅胶拌样后，上100-200目硅胶柱，用3-5倍柱体积乙酸乙酯-乙醇洗脱，乙酸乙酯和乙醇重量比为25:1-5:1，将含有重楼皂苷VI成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；4）步骤3）得到的样品用40%-60%乙醇溶解后上反相柱，依次用2-4倍柱体积60%-70%乙醇、3-5倍柱体积75%-85%乙醇洗脱，取75%-85%乙醇洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：万近福，李晋玉，韦迪，梅双喜，崔涛，王京昆，朱兆云，张梦麒，丁茜，郭琰，
申请(专利权)人：云南省药物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53