用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板制造技术

本发明专利技术公开了一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板及检测方法。该甲基化面板共包含18个基因，通过检测患者血浆中BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2，CHR8:20共10个基因甲基化水平的改变，用于肝癌的诊断和疗效预测；通过检测患者血浆中SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2，TMEM8B共8个基因甲基化水平的改变，用于预测肝癌患者的预后和死亡风险。通过上述技术方案，提高了通过肝癌患者血液诊断和预后预测的准确性。

Gene methylation panel for diagnosis and prediction of curative effect and prognosis of liver cancer

The invention discloses a gene methylation panel for detecting and predicting the curative effect and prognosis of liver cancer and a detection method thereof. The methylation panel contains a total of 18 genes by BMPR1A in plasma of patients with detection PSD4, ARHGAP25, KLF3, PLAC8, ATXN1, CHR6:170, CHR6:3, ATAD2, CHR8:20 10 gene methylation level changes for diagnosis and curative effect prediction of liver cancer; by SH3PXD2A, were detected in the plasma C11ORF9, PPFIA1. CHR17:78, SERPINB5, NOTCH3, GRHL2, TMEM8B 8 gene methylation level changes, is used to predict the prognosis of HCC patients and the risk of death. Through the technical proposal, the accuracy of the blood diagnosis and prognosis prediction of the patients with liver cancer is improved.

【技术实现步骤摘要】
用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板
本专利技术涉及基因表观遗传学
，尤其是一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板，以及利用该基因甲基化面板诊断肝癌、预测疗效和复发情况，以及预测肝癌预后和死亡风险的方法。
技术介绍
肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是我国常见恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿，早期没有症状，且多数患者缺乏普查意识，往往出现症状才到医院就诊而被诊断为晚期肝癌，而晚期肝癌治疗效果很不理想，平均生存期一般只有3-6个月。对于肝癌患者而言，如果早期发现和诊断肝癌，就更有可能接受根治性治疗(手术、消融等)，其治疗效果和预后均明显优于晚期肝癌。因此，肝癌的早期诊断意义非常重大。正常生理条件下，人体血循环中存在由凋亡和坏死的细胞释放的游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)，肿瘤患者的血循环中还可检测到游离循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)，由于ctDNA携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，并且能全面的反映患者体内肿瘤细胞的遗传信息和演变进程，可以作为理想的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊断、分子分型、疗效评价和追踪以及预后评估。肿瘤细胞中的遗传学异常表现多样且存在明显的个体性，包括突变(Mutation)，拷贝数变异(Copy-numbervariation)，微卫星不稳定(MicrosatelliteInstability)，杂合性缺失(LossofHeterozygosity)等。这些异常不仅在不同肿瘤之间差异很大，即使在同一肿瘤的不同患者之间也具有高度的个体异质性(IndividualHeterogeneity)，使得在ctDNA中检测这些改变和结果分析异常复杂。与此相比，在多种肿瘤的ctDNA中可检测到相似的甲基化改变，而同一类型肿瘤ctDNA的甲基化谱则更为稳定和一致。随着甲基化特异性PCR、二代测序(next-generationsequencing，NGS)等技术的飞速发展，使得高通量、准确、相对廉价的DNA甲基化谱检测成为可能，也促使ctDNA甲基化谱的检测日益成为目前液体活检技术的热点之一，可以准确筛查早期或超早期癌症，有助于癌症的早期诊断、早期评估、早期预防、早期治疗。
技术实现思路
本专利技术公开了一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板，以及利用该面板诊断肝癌、预测疗效和复发情况，以及预测肝癌预后和死亡风险的方法第一个方面，本专利技术提供一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板，所述基因甲基化面板包括第一组甲基化基因和第二组甲基化基因，所述第一组甲基化基因包括BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2和CHR8:20，所述第二组甲基化基因包括SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2和TMEM8B。进一步地，所述基因甲基化面板测定肝癌患者血浆中的BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2和CHR8:20的甲基化水平改变，以诊断肝癌和预测肝癌的治疗疗效、预测肝癌复发。进一步地，所述基因甲基化面板测定肝癌患者血浆中的SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2和TMEM8B的甲基化水平改变，以预测肝癌患者的预后和死亡风险。第二个方面，本专利技术提供一种上述用于预测肝癌复发和预后的基因甲基化面板的检测方法，包括以下步骤：第一步，在血浆中提取ctDNA；第二步，对提取的所述ctDNA进行亚硫酸盐转化，使所述ctDNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸盐转化ctDNA；第三步，用深度测序的方法测定所述亚硫酸盐转化ctDNA的甲基化水平的改变；第四步，探针的设计和合成；第五步，通过所述探针对所述亚硫酸盐转化ctDNA进行捕获扩增并进行测序；第六步，数据的分析和模型的建立。在本专利技术的检测方法的第一步中，血浆可以是正常人的血浆或者肝癌患者的血浆。ctDNA(circulatingtumorDNA)是指循环肿瘤DNA。在本专利技术中，深度测序也称高通量测序技术，为本领域技术人员所知晓的一种测序技术。进一步地，第四步所述探针的设计和合成采取以下步骤；首先，对TCGA和GSE数据库里的肝癌组织样本和正常人血浆样本的450K基因甲基化芯片数据进行分析，找出甲基化水平明显差异的基因；然后，在同一患者的肝癌组织和血浆样本中用深度测序的方法测定上一步筛选出的所述基因的甲基化水平的改变，进一步筛选出同时能在患者肝癌组织和血浆中检测出来且甲基化水平变化一致的基因；其中，“测定上一步筛选出的所述基因的甲基化水平的改变”是指对450K基因甲基化芯片数据进行分析的步骤中所筛选出的甲基化水平明显差异的基因，对这些基因的甲基化水平的改变进行测定。针对筛选出来的甲基化水平变化一致的基因设计探针并合成。在本专利技术中，采用常规探针设计软件设计探针，例如采用ppDesigner软件设计上述同时能在同一患者的肝癌组织和血浆里检测出来且甲基化水平变化一致的基因探针。探针的合成方法采用现有成熟技术即可，例如可应用核酸杂交技术，用单独的寡核苷酸进行探针合成。在本专利技术中，可以通过本领域常用方法使用探针捕获亚硫酸盐转化ctDNA，经扩增后进行相应测序。或者，采用以下步骤进行捕获扩增后并测序：首先，将所述亚硫酸盐转化ctDNA与第四步中合成的所述探针混合于反应缓冲液中形成反应液，在所述反应液上加矿物油；然后，对所述反应液进行退火和变性，PCR扩增并给每个血浆样本附上条码，PCR反应建立文库，并保留有效的捕获，去除空白的捕获；用Illumina公司的适配引物和浓度以PCR方法纯化所建文库，采用Illumina公司的Miseq和Hiseq2500系统来进行测序，得到测序结果。在本专利技术中，所述反应缓冲液采用本领域中在进行DNA捕获时的常用反应缓冲液即可。优选地，所述亚硫酸盐转化ctDNA与所述探针按照1:20000的摩尔比混合；在本专利技术中，在所述反应液上加矿物油的目的是防止反应液蒸发。进一步地，在所述用于预测肝癌复发和预后的基因甲基化面板的检测方法中，还包括在第五步后进行优化捕获：对所述测序结果进行相对效率计算，混合探针时根据采用调节后的摩尔比率进行混合。在本专利技术中，由于在第五步中，测序的原始捕获实验结果(即测序结果)在高效率的探针和低效率的探针中读取的结果有显著差异，为了改善这种情况，故需进行优化捕获，使测序的覆盖更加均匀、测序结果更加合理。进一步地，第六步中，所述数据的分析和模型的建立采取以下步骤：首先，通过将肝癌血浆样本和正常对照的血浆样本随机按2:1的比例分为训练集和验证集，选用LASSO和随机森林的方法对第五步中的所述基因的甲基化测序结果进行筛选，两种方法重叠的基因有10个，分别为BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2，CHR8:20；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板，其特征在于：包括第一组甲基化基因和第二组甲基化基因，所述第一组甲基化基因包括BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2和CHR8:20，所述第二组甲基化基因包括SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2和TMEM8B。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板，其特征在于：包括第一组甲基化基因和第二组甲基化基因，所述第一组甲基化基因包括BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2和CHR8:20，所述第二组甲基化基因包括SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2和TMEM8B。2.根据权利要求1所述的基因甲基化面板，其特征在于：所述基因甲基化面板测定肝癌患者血浆中的BMPR1A，PSD4，ARHGAP25，KLF3，PLAC8，ATXN1，CHR6:170，CHR6:3，ATAD2和CHR8:20的甲基化水平改变，以诊断肝癌和预测肝癌的治疗疗效。3.根据权利要求1所述的基因甲基化面板，其特征在于：所述基因甲基化面板测定肝癌患者血浆中的SH3PXD2A，C11ORF9，PPFIA1，CHR17:78，SERPINB5，NOTCH3，GRHL2和TMEM8B的甲基化水平改变，以预测肝癌患者的预后和死亡风险。4.一种如权利要求1-3任一项所述的用于诊断、预测肝癌疗效和预后的基因甲基化面板的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，在血浆中提取ctDNA；第二步，对提取的所述ctDNA进行亚硫酸盐转化，使所述ctDNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸盐转化ctDNA；第三步，用深度测序的方法测定所述亚硫酸盐转化ctDNA的甲基化水平的改变；第四步，探针的设计和合成；第五步，通过所述探针对所述亚硫酸盐转化ctDNA进行捕获扩增并进行测序；第六步，数据的分析和模型的建立。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，第四步中所述探针的设计和合成采取以下步骤：首先，对TCGA和GSE数据库里的肝癌组织样本和正常人血浆样本的450K基因甲基化芯片数据进行分析，找出甲基化水平明显差异的基因；然后，在同一患者的肝癌组织和血浆样本中用深度测序的方法测定第三步中？还是对450K基因甲基化芯片进行分析后找出的甲基化水平明显差异的基因筛选出的所述基因的甲基化水平的改变，进一步筛选出同时能在患者肝癌组织和血浆中检测出来且甲基化水平变化一致的基因；...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐瑞华，张康，骆卉妍，韦玮，侯睿，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：广东,44