小苍兰花叶病毒RT‑LAMP检测引物及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种小苍兰花叶病毒RT‑LAMP检测引物及检测方法，针对FreMV的CP基因为靶基因设计针对6个区域的4条特异性引物，应用DNA链置换聚合酶,在恒温条件下快速对靶基因进行RT‑LAMP扩增。本发明专利技术能特异性扩增FreMV，与其他4种病毒不发生反应，灵敏度为RT‑PCR的10倍，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点，不需要特殊仪器等优点，在基层和现场检测中有很好的应用前景。

Freesia mosaic virus RT primers for LAMP detection and its detection method

The invention provides a Freesia mosaic virus RT primers for LAMP detection and detection method for CP FreMV gene as the target gene for 4 specific primers of 6 regions, the application of DNA strand displacement polymerase, under constant temperature condition of the RT LAMP amplification of target gene. The invention can FreMV specific amplification, and the other 4 viruses do not react, the sensitivity is 10 times RT PCR, has the characteristics of strong specificity, high sensitivity, simple and quick, do not need special equipment and other advantages, has a good application prospect in the detection of primary and field.

【技术实现步骤摘要】
小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测引物及其检测方法
本专利技术涉及一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测引物及其检测方法。
技术介绍
小苍兰花叶病毒(Freesiamosaicvirus，FreMV)是危害小苍兰最严重最常见的病毒之一。小苍兰花叶病毒侵染小苍兰，会影响小苍兰观赏和利用价值，造成花色杂，花朵数量骤减，植物生长不良，严重影响其观赏价值，发病严重时，甚至造成种球的退化，失去再利用的价值，已经成为小苍兰大规模生产的主要限制因素。目前，小苍兰病毒尚无特别有效的化学防治方法，培育和栽培无病毒苗成为防治小苍兰病毒的根本措施，在无毒苗培育过程中，经常需要对母本及脱毒苗进行病毒检测，建立快速、灵敏的检测技术显得尤为重要。目前，病毒检测主要有电镜观察法，酶联免疫法、PCR检测法等几种方法。传统的电镜法费时费力，需要有经验的专业人员才能鉴定，酶联免疫法是目前较常用的一种方法，但也存在灵敏度不高的缺陷，灵敏度更高的PCR技术已成为常规检测手段，但由于实验设备要求高，不利于向基层检验检疫部门推广。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一，在于提供一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测引物。本专利技术是这样实现的：一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测引物，包括以下两引物对：外引物F3：5'-GACGAGGTGCGATACCAAGC-3'，外引物B3：5'-CCTTCAATTTTGCCAACCTTGG-3'；内引物FIP：5'-CACTCCTTGCTTTTCGCCTTCGCGAATTCAGCAACTTGACGCTGGGGCT-3'；内引物BIP：5'-GAGCGCGAAATTGCAAAGAATAGCGGAATTCTTGCTCGTGAACCCACATCCAC-3'。本专利技术要解决的技术问题之二，在于提供一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测方法。本专利技术是这样实现的：一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测方法，利用所述的引物对小苍兰花叶病毒进行RT-LAMP扩增检测，其中反应体系和反应程序具体如下：反应体系：2.5μL10×Bstbuffer、4μLMgSO4(25mmol/L)、4μL甜菜碱(5mmol/L)、4μLdNTPs(2.5mmol/L)、1μLBst聚合酶(8U/μL)、2μL的引物FIP(20μmol/L)、2μL的引物BIP(20μmol/L)、0.5μL的引物F3(10μmol/L)、0.5μL的引物B3(10μmol/L)、2μLddH2O、2.5μLcDNA，反应体系的总体积为50μL；反应程序为：65℃60min，80℃5min。本专利技术的优点在于：具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层和现场检测中有很好的应用前景。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术中FreMV的RT-LAMP扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术中酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。图3是本专利技术中RT-LAMP扩增检测FreMV灵敏度实验结果的1％琼脂糖凝胶电泳图。图4是本专利技术中RT-PCR扩增检测FreMV灵敏度实验结果的1％琼脂糖凝胶电泳图。图5是本专利技术中RT-PCR扩增检测FreMV特异性实验结果的1％琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测方法，具体如下：步骤100：根据GenBank公布的FreMV较保守的CP基因序列(CP基因序列如SEQIDNO：5)为靶标基因应用LAMP引物设计软件primerexplorer4.0(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，得到针对6个区域的4条特异性引物，并由上海生工生物工程有限公司合成上述两对特异性引物。应用DNA链置换聚合酶(BstDNApolymerase),在恒温条件下快速对靶基因进行RT-LAMP扩增。其中，各引物对具体为：外引物F3:5'-GACGAGGTGCGATACCAAGC-3'(序列如SEQIDNO：1)，外引物B3：5'-CCTTCAATTTTGCCAACCTTGG-3(序列如SEQIDNO：2)'；内引物FIP:5'-CACTCCTTGCTTTTCGCCTTCGCGAATTCAGCAACTTGACGCTGGGGCT-3'(序列如SEQIDNO：3),内引物BIP:5'-GAGCGCGAAATTGCAAAGAATAGCGGAATTCTTGCTCGTGAACCCACATCCAC-3'(序列如SEQIDNO：4)。步骤200：RNA提取：将被FreMV侵染的叶片0.2g、健康叶片0.2g分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。RNA提取采用Trizol法：0.2g带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加入液氮研磨成粉状，接着将粉状叶片置于第一离心管中，再加入1mLTrizol并剧烈震荡20～30S，然后将第一离心管置于室温下静置5min以使叶片充分裂解，接着将第一离心管于10000rpm下离心5min，将上清液移至第二离心管中，加入200uL氯仿，并振荡混匀，于室温下放置3min，接着在4℃、10000rpm下离心15min，然后吸取上层水相至第三离心管中，往第三离心管中加入0.5mL异丙醇混匀，并于室温下放置10min，接着将第三离心管于4℃、10000rpm条件下离心10min，并弃去上清液，则RNA沉于管底；之后加1mL75％乙醇(DEPC处理水配制)于第三离心管中并温和振荡第三离心管，得到悬浮液，再于4℃、10000rpm条件下离心5min，并弃去上清液，然后将第三离心管置于冰上晾干10min，最后用30uLDEPC处理水溶解RNA样品。步骤300：反转录cDNA，将经步骤200处理所得的RNA反转录成cDNA，具体内容为：将反应管置于冰上，加入1uLPrimerOligo(dt)、1uLdNTP混合物(10mmol/L)、4uLDEPC处理水、4uLRNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于65℃水浴中加热5min后，立即将反应管置于冰上5min，接着将反应管稍微离心后再将反应管置于冰上，并加入4uL5×反转录酶缓冲液、0.5uL20U/uL的RNAase抑制剂、1uL200U/uL反转录酶、4.5uLDEPC处理水至反应管中，然后将反应管置于42℃水浴中加热60min，再将反应管置于70℃下热击10min，最后终止反应。步骤400：PCR扩增：以经步骤300处理所得的cDNA为模板，并以步骤100中获得的二对引物为引物对进行LAMP扩增，得到扩增产物，其中RT-LAMP反应的反应体系和反应程序如下：反应体系(25μL)：2.5μL10×Bstbuffer、4μLMgSO4(25mmol·L-1)、4μLBetaine(5mmol·L-1)、4μLdNTPs(2.5mmol·L-1)、1μLBst聚合酶(8U·μL-1)、2μL引物FIP(20μmol·L-1)、2μL引物BIP(20μmol·L-1)、0.5μL引物F3(10μmol·L-1)、0.5μL引物B3(10μmol·L-1)、2μLddH2O、2.5μLcDNA；反应程序为：65℃60min，80℃5min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小苍兰花叶病毒RT‑LAMP检测引物，其特征在于：包括以下两引物对：外引物F3：5'‑GACGAGGTGCGATACCAAGC‑3'，外引物B3：5'‑CCTTCAATTTTGCCAACCTTGG‑3'；内引物FIP：5'‑CACTCCTTGCTTTTCGCCTTCGCGAATTCAGCAACTTGACGCTGGGGCT‑3'；内引物BIP：5'‑GAGCGCGAAATTGCAAAGAATAGCGGAATTCTTGCTCGTGAACCCACATCCAC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测引物，其特征在于：包括以下两引物对：外引物F3：5'-GACGAGGTGCGATACCAAGC-3'，外引物B3：5'-CCTTCAATTTTGCCAACCTTGG-3'；内引物FIP：5'-CACTCCTTGCTTTTCGCCTTCGCGAATTCAGCAACTTGACGCTGGGGCT-3'；内引物BIP：5'-GAGCGCGAAATTGCAAAGAATAGCGGAATTCTTGCTCGTGAACCCACATCCAC-3'。2.一种小苍兰花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊荣辉，黄敏玲，钟淮钦，叶秀仙，罗远华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35