本发明专利技术公开了一种用于修饰蛋白质的活化的聚乙二醇（二醇）及制备方法。将聚乙二醇二酸在有机相中，加入活化试剂和含有等摩尔氨基的封闭试剂反应，然后从反应产物中收集活化的聚乙二醇（二醇），所述的活化的聚乙二醇（二醇）可用于修饰蛋白质。本发明专利技术合成路线设计合理，所用试剂价格低廉，总产率在９０％以上。活化的聚乙二醇（二醇）的结构通式如上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能够用于修饰蛋白质的活化的聚乙二醇(二醇)及其制备方法。
技术介绍
随着生物技术的快速发展，越来越多具有生物活性的多肽，蛋白质，酶被人们用于临床治疗。然而这些生物大分子在直接应用于人体时存在着一些缺陷。这些缺陷包括1.快速排除，2.生物降解，3.引起免疫反应等等。因此，蛋白质特别是药用蛋白质的化学修饰至今仍然是一个热门的研究领域。许多天然及合成的分子正在被用做化学修饰。聚乙二醇，这种合成的分子由于其生物相容性，对人体无毒，能够降低被修饰物的抗原性等优点被广泛用于蛋白质，多肽，酶甚至一些小分子药物的修饰。聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的聚合物。当与蛋白质(还有多肽，酶及其他生物活性分子)共价结合时，聚乙二醇能够弥补这些分子本身的不足，扩大其潜在的应用。与未修饰的对照物相比，PEG-蛋白质结合物这种改良了的药理学性质激发了人们开发这种结合物作为制剂的热情。例如，PEG-腺苷脱氨酶已获得FDA的批准；PEG修饰的细胞因子已被制成并且PEG修饰的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)显示了两种不相关联的生物学性质。由于两端含有羟基的聚乙二醇(二醇)活化后修饰蛋白质会引起蛋白质交联反应，修饰蛋白质的聚乙二醇通常都采用一端由甲基封闭的单甲氧基聚乙二醇。这种用于药物修饰的单甲氧基聚乙二醇，由于难于制备，价格十分昂贵，而这种状况限制了聚乙二醇修饰研究的开展和修饰产品的研制。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题旨在提供一种新的。本专利技术的用于修饰蛋白质的活化的聚乙二醇(二醇)结构通式如下 其中X代表环戊胺、环己胺、4～8碳的脂肪族伯胺或单甲氧基聚乙二醇伯胺，Y代表、氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)或二羟基吡啶，n＝20～450。优选的用于修饰蛋白质的活化的聚乙二醇(二醇)选自分子量为2000～20000的PEG二醇，如PEG10000(聚乙二醇10000)本专利技术的制备方法包括如下步骤将聚乙二醇二酸在有机相中，加入活化试剂和含有等摩尔氨基的封闭试剂反应，反应时间为24～48小时，反应温度为4～25℃，然后从反应产物中收集目标产物----单端封闭的聚乙二醇(二醇)；反应原料的摩尔比为聚乙二醇二酸∶活化试剂＝1∶1～4。所说的有机相选自二氯甲烷或氯仿中的一种；所说的活化试剂选所说的活化试剂选自氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)或二羟基吡啶；所说的封闭试剂选自环己胺、丁胺或分子量为800～2000的单甲氧基聚乙二醇伯胺；所说的聚乙二醇二酸的结构通式如下 可采用如下的方法进行制备，方法1氧化法将聚乙二醇(二醇)溶于二氯甲烷中，加入2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基，在微量硝酸的作用下，反应6～24小时，即得到聚乙二醇二酸，产率95～99％；聚乙二醇(二醇)∶2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基＝1∶1～3，摩尔比；所说的2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基可购买到。方法2成醚法将聚乙二醇(二醇)1毫摩尔溶于甲苯中，蒸馏出一部分甲苯共沸除水，然后加入3～6毫摩尔的叔丁醇钾回流反应1～2个小时，而后缓慢加入3～6毫摩尔的溴乙酸叔丁酯回流反应2～4小时，然后室温反应18～24小时，过滤除去沉淀后减压蒸去溶剂，残留物加入少量二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出产物，将该产物溶于去离子水中，逐渐加入0.1摩尔的氢氧化钠溶液直到溶液的pH值稳定在pH10，然后用0.1摩尔的盐酸调节溶液的pH到4，采用常规的方法收集聚乙二醇二酸。本专利技术在活化反应的同时对聚乙二醇(二醇)的一端进行封堵的方法，成功地制备了单端活化的不同分子量的聚乙二醇，使用上述两种活化的聚乙二醇分别对细胞因子类人重组干扰素a-2b和白介素-2进行了修饰，取得了良好的结果。本专利技术合成路线设计合理，所用试剂价格低廉，总产率在90％以上。附图说明图1为聚乙二醇(二醇)原料的红外图谱。图2为封堵活化产物的红外图谱。图3为封堵活化产物(MW应为12,000)的GPC图谱。图4为购买的标准mPEG-OH(MW12,000)的GPC图谱。图5是使用环己胺封堵活化的分子量为10,000的聚乙二醇修饰白介素-2的电泳图(SDS-PAGE)。图6为使用mPEG-NH2封堵活化的分子量约为12kD的活化产物修饰干扰素alpha-2b的电泳图(SDS-PAGE)。实施例1单端用环己胺封闭的分子量为10kD的活化PEG的制备将分子量为10kD的聚乙二醇10g(1mmol)溶于20ml精制二氯甲烷中，然后加入100mg的2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基，在少量的硝酸的作用下反应24小时，然后用无水乙醚沉淀出产物，干燥后用0.01N的氢氧化钠滴定测定羧基含量，得二酸产率为99％；取5g上述的PEG二酸溶于30ml精制二氯甲烷中，加入2倍摩尔量的DCC和NHS，再加入1.2倍摩尔量的环己胺，室温反应48小时后，用干燥的无水乙醚沉淀出产物，产物经真空干燥后取少量做红外光谱测定，见图1和图2。图1为聚乙二醇(二醇)原料的红外图谱。在1600cm-1～1800cm-1间无吸收；图2为封堵活化产物的红外图谱，在1600cm-1～1700cm-1之间有酰胺羰基的特征吸收，在1700cm-1～1800cm-1之间有酯羰基的特征吸收。实施例2单端用mPEG-NH2封闭的分子量为12kD的活化PEG的制备取mPEG2000 10g(5mmol)加入300ml分析纯甲苯中，蒸馏出150ml以共沸除水，然后加入10mmol的氯化亚砜，在缓慢滴加10mmol的无水吡啶后回流反应8小时，过滤后减压将体系蒸干。残渣用干燥的二氯甲烷溶解后，再用干燥的无水乙醚沉淀出产物，得到mPEG-Cl，将得到的mPEG-Cl在液氨的作用下胺化得到mPEG-NH2。取5g按1.2.1中制备的分子量为10kD的PEG二酸溶于30ml精制的二氯甲烷中，加入2倍摩尔量的DCC和NHS，然后加入1.2倍摩尔量的mPEG-NH2室温下搅拌反应48小时，产物经乙醚沉淀后真空干燥，去少量进行红外光谱测定和GPC测定。GPC图谱见图3和图4。图3为封堵活化产物(MW应为12,000)的GPC图谱。图4为购买的标准mPEG-OH(MW12,000)的GPC图谱。可以看出，两者的保留时间都在25～30分钟，因此，说明封堵活化产物的分子量为12,000。实施例3用单端封闭的活化聚乙二醇(MW10kD)修饰白细胞介素-2取浓度为lmg/ml的IL-2 200ul，用0.1M磷酸缓冲液调节至pH7.0，然后加入用环己胺单端封闭的活化PEG10kD，使蛋白质与修饰剂的摩尔比为1∶5，反应30分钟后用2N的甘氨酸终止反应。用活化的mPEG5kD做为对照进行上述反应，修饰结果用SDS-PAGE检测，图5是使用环己胺封堵活化的分子量为10,000的聚乙二醇修饰白介素-2的电泳图(SDS-PAGE)。图中泳道1为分子量5kD的活化mPEG修饰条带，泳道2为封堵活化产物的修饰条带，此修饰条件为pH6.0；修饰反应产物为但修饰产物；而泳道4，5分别为mPEG5kD和封堵活化产物在pH8下的修饰条带。可以看出，5kD对IL-2的单修饰条带分子量在25kD；封度活化产物的单修饰条带的单修饰产物的分子量在32kD，而pH8下的修饰只多出了46kD左右的修饰条带，并未产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种活化的聚乙二醇（二醇），其特征在于，结构通式如下：Ｘ－ＮＨＯＣ－（－ＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］Ｏ－）↓［ｎ］－ＣＨ↓［２］ＣＯＯＹ其中：Ｘ代表环戊胺、环己胺、４～８碳的脂肪族伯胺或单甲氧基聚乙二醇伯胺，Ｙ代表、氮羟基琥珀酰 亚胺或二羟基吡啶，ｎ＝２０～４５０。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：何明磊，魏东芝，熊玉春，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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