提高氮素高效利用的真菌TrGDH蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域,公布了一个能提高水稻氮素高效利用的真菌（

Fungal TrGDH protein for improving high nitrogen utilization and application thereof

The invention belongs to the field of plant gene engineering, and discloses a fungus capable of improving the efficient utilization of nitrogen in Rice

【技术实现步骤摘要】
提高氮素高效利用的真菌TrGDH蛋白及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，本专利技术涉及在水稻(OryzasativaL.)中异源表达真菌Trichurus的谷氨酸脱氢酶基因TrGDH，可以提高水稻的氮素高效利用和改善水稻的生长。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是氮肥用量最多的粮食作物之一，也是对干旱极度敏感的作物。据世界粮农组织(FAO2001)统计，中国1995-1997年水稻种植面积年均31.7×106hm2，占世界水稻种植面积的20%，而水稻氮肥用量占全球水稻氮肥总用量的37%，成为世界上施用无机氮肥最多的国家。中国单季稻田氮肥用量平均为180kg/hm2，比世界稻田氮肥平均用量约高75%(彭少兵等2002)。水稻的氮肥低效利用与超量施用的现实，加剧了诸如富营养化、空气污染等严重环境问题；同时，我国水稻生产受干旱的威胁日益严重。因此，培育氮高效利用和抗旱性强的水稻新品种对提高我国粮食产量和维持农业可持续发展非常重要（Batesetal.2008;Xuetal.2012）。植物的氮源主要来自于无机氮化物，如铵盐（NH4+)和硝酸盐（NO3-)。但是水稻在大田中能利用的无机氮源主要形式为铵盐（NH4+)。水稻体内NH4+同化包括两个途径：谷氨酰胺合成酶(GS)-谷氨酸合酶（GOGAT）途径[8]和谷氨酸脱氢酶（GDH）途径（江立庚等2002;Qiuetal.2009）。高等植物体内NH4+同化的主要途径为GS/GOGAT，而GDH可能是辅助NH4+同化，并参与调控体内的碳氮代谢的平衡（Lea和Miflin1974；Abikoetal.2005；Qiuetal.2009）。谷氨酸脱氢酶（GDH；E.C.1.1.4.1）催化反应为：α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+H+→谷氨酸+H2O+NAD(P)+。在生物体中，GDH分为2类：一类为以NADPH为辅酶的NADPH-GDH，主要作用于谷氨酸的合成;另一类为以NADH为辅酶的NADH-GDH，主要作用于谷氨酸的分解（Loulakakisetal.1991;Bernardetal.2009）。本专利技术中以下所指的GDH就是NADPH-GDH。在高等植物中虽存在GDH基因，但由于其GDH对NH4+的亲和力低（Km为10mM-80mM)，而来源于真菌的GDH对NH4+的亲和力非常高（Km为0.2mM-4.5mM)，预示真菌GDH在低NH4+浓度时的氨同化能力比高等植物强（Abikoetal.2010;Zhouetal.2014）。因此，利用外源谷氨酸脱氢酶（主要是细菌和真菌）提高植物氮肥利用率是现在国内外生物工程研究的热点之一。Lightfootetal.（2001）将大肠杆菌（E.coli）的gdhA基因在烟草中表达，发现转基因植株能够增强对PPT(phosphinothricinherbicides)的耐受力，而且氮素利用效率明显提高。Lightfootetal.（2007）将大肠杆菌E.coligdhA基因转入玉米中，发现转基因植株在明显缺水的季节里的萌发率和生物产量均比对照高，其氮素利用效率也明显提高，说明该基因在植株中高效表达即可以提高氮素利用效率，又可以使植物耐旱性增强。特别是在半干旱地区，作物谷氨酸脱氢酶改造具有很好的应用前景。朱冰等（2000）克隆了地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）谷氨酸脱氢酶基因并研究了其表达和功能。王芳和田波（2001）通过RT-PCR方法克隆了真菌中间脉孢霉（Neurosporaintermedia）、好食脉孢霉（Neurosporasitophila）、粗糙脉孢霉（Neurosporacrassa）的谷氨酸脱氢酶基因。重组谷氨酸脱氢酶活性分析表明：Ni-GDH具有更高的酶活性，其Km值在0.3-0.45mmol/L左右。将其转入烟草，发现它能促进烟草在低氮水平下的生长。黄国存等利用RT-PCR方法从小球藻(Chlorellasorokiniana)中克隆了NADPH-GDH基因，并转入烟草(NicotianatabacumL.)。研究表明,在低氮培养基或在低氮蛭石中其生长速度和叶片数明显高于对照。同时，铵毒性实验表明,无论在低铵或高铵条件下，接种在MS固化培养基上的转基因绿叶圆片存活时间长,叶绿素含量高（黄国存等，2002）。以上这些研究结果表明，外源NADPH-GDH在提高植物氮素的吸收和利用能力上具有巨大潜力和应用价值。外源GDH在水稻中的应用方面，已有多个真菌GDH基因已转入水稻并展现了较好的应用前景。Abiko等（2010）将黑曲霉（Aspergillusniger）的GDH基因表达于水稻中，显著提高了水稻的氮同化效率和产量。同时，Zhou等（2015）将埃伦柱孢（Cylindrocarponehrenbergii）的CeGDH基因转入水稻，获得了氮素同化效率和谷物产量均显著提高的转基因株系，尤其在低氮大田中其增产效果非常显著。然而，Zhou等（2014）将鲍鱼菇（Pleurotuscystidiosus）的PcGDH基因转入水稻，获得了氮同化效率和谷蛋白含量显著提高的转基因株系，而其产量提高不明显。另外，Du等（2014）粗糙脉孢杆菌（Neurosporacrassa）的NcGDH基因导入水稻，却发现转基因水稻的生长受到抑制，但是其耐除草剂Basta的能力显著提高。以上研究发现，真菌GDH基因虽能增强水稻的氮同化效率，但是并不一定能增加产量，甚至有时还降低产量。因此，筛选和鉴定既能增强氮同化效率又能增加产量的新的真菌GDH基因仍显得十分紧迫，而且也具有现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种真菌Trichurus的谷氨酸脱氢酶基因及其编码蛋白，该基因命名为TrGDH，所编码的相应蛋白命名为TrGDH蛋白。TrGDH序列全长为1359bp，编码452个氨基酸。本专利技术所提供的谷氨酸脱氢酶蛋白，名称为TrGDH，来源于真菌Trichurus，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQIDNo:2；序列表SEQIDNo:2中的序列由452个氨基酸残基组成。TrGDH的编码基因也属于本专利技术的保护范围。TrGDH的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中SEQIDNo:1的DNA序列；2）编码序列表中SEQIDNo:2蛋白质序列的多核苷酸；3）在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4）与序列表中SEQIDNo:1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中的序列1由1359个碱基组成。所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜含有TrGDH基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。真菌Trichurus的谷氨酸脱氢酶基因(TrGDH)及其编码蛋白属于本专利技术的保护范围，且扩增TrGDH基因中任意片段的引物也在本专利技术的保护范围之内。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的提高水稻氮素高效利用的基因TrGDH导入植物细胞，可获得改善水稻氮素高效利用及生长的转基因植株。本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻氮素高效利用蛋白，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQ ID No:2；2）将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与水稻氮素高效利用相关的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.水稻氮素高效利用蛋白，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：1）序列表中的SEQIDNo:2；2）将序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与水稻氮素高效利用相关的蛋白质。2.权利要求1所述的水稻氮素高效利用蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述水稻氮素高效利用蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列；2）编码序列表中SEQIDNo:2所示蛋白质序列的多核苷酸；3）在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4）与序列表中SEQIDNo:1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。4.含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘选明，杜长青，林建中，唐冬英，赵小英，朱咏华，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43