一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用。本发明专利技术的核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为米氏硫胺素芽孢杆菌(

【技术实现步骤摘要】
一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用。
技术介绍
核苷和脱氧核苷是由核苷碱基分别和核糖或脱氧核糖以苷键形式而构成的，它们是组成核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的基本元件，是遗传基因的基础。核苷和脱氧核苷系列衍生物具有多种生物活性物质，可以作为核酸代谢抑制剂，用于干扰肿瘤细胞的生长和病毒的繁殖，起到抗病毒和抗肿瘤的作用。因其可以直接或间接地作为药物使用，在治疗多种重大的疾病方面起到极其重要的作用，所以核苷类似物的合成一直以来被全世界的科学家所研究，目前已经合成了千余种核苷类似物，并有不少已作为抗肿瘤或抗病毒药物应用于临床，如：齐多夫定、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、阿洛夫定等。核苷类似物与核苷酸在化学结构上具有类似性，可以假乱真混入DNA合成的过程中，但因其不具备核苷酸的功能，所以导致合成的核酸链失去了正常的功能。通过氮杂、脱氮、取代等化学修饰方法，对正常碱基的嘧啶和嘌呤进行修饰就可得到核苷类药物。核苷类似物在病毒或肿瘤细胞的遗传物质表达的过程中，被整合到DNA链中，不仅大大降低了聚合酶的活性，也终止了DNA的合成，从而使病毒细胞无法增殖传代，导致病毒的灭亡。在各种各样的重要的生物类核苷中，腺苷类似物尤其是2，6-二卤代嘌呤核苷是非常有价值的。例如克拉屈宾、氯法拉宾、氟达拉宾在最近的二十年内被广泛关注，尤其在白血病方面具有极大的治疗潜力。2-氯腺嘌呤核苷作为腺苷受体的拮抗剂可引起少数细胞的细胞凋亡，2-氟脱氧腺苷和2-氟腺苷在上个世纪中期被首次合成，并且是腺苷类似物中首批成员，他们针对肿瘤细胞具有很高的抑制细胞活性。核苷类化合物的合成方法主要采用化学法和生物法。核苷类化合物传统的合成方法多为化学合成法。较为经典的方法就是采用碱基与核糖进行缩合，得到α、β同分异构体，然后去掉保护基团后，再进行分离；也可以以天然的核苷为原料，对其碱基或核糖基进行修饰。化学合成的缺点非常明显，就是步骤繁多，需要对碱基或核糖基上的活性基团进行修饰保护，并且最终的转化率不高，产物成分复杂，一般得到的是α、β同分异构体，还需要对其拆分才能得到有活性的β型核苷，因此分离纯化难度大。例如阿糖腺苷的合成，以天然核苷尿苷为底物经过一系列的步骤反应得到阿糖腺苷，化学合成路线如下：生物法合成核苷类化合物主要有发酵法、全细胞催化法和酶法。有文献报道通过生物发酵可以得到大量天然的非脱氧核苷(如腺苷、肌苷、鸟苷、胞苷)，其产量十几克/升到几十克/升，都以实现了工业化生产。利用微生物发酵法生产核苷，极大地推动了核酸药物的发展，为其他的核酸药物合成与研究提供了廉价的原料。但是发酵法生产核苷目前还只限于天然的几种非脱氧核苷，对脱氧核苷和修饰过的核苷还无能为力。目前使用完整的细菌细胞作为生物催化剂也是有报道的，来催化合成许多生物学上重要的核苷(阿糖腺苷、阿糖鸟苷、克拉屈滨、氟达拉滨、2-氟脱氧腺苷)。全细胞代表着一类天然固定化核苷磷酸化酶，但是它存在着以下几点限制：全细胞内存在着许多的酶，(1)这些酶可以消耗底物；(2)这些酶可以催化底物形成一些副产物；(3)而且细胞分泌的代谢物给后期的纯化带来了一定的困难。酶法合成2,6-二卤代嘌呤核苷主要利用核苷磷酸化酶作为催化剂，核苷磷酸化酶主要有俩大类：嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶。它们广泛存在于动植物和微生物中，主要参与细胞核酸代谢途径中的代谢，它们在补救途径中催化核苷或脱氧核苷的糖苷键的可逆磷酸化反应，提供核糖-1-磷酸，并释放出碱基，加入其他碱基可形成一种新的核苷。嘌呤核苷磷酸化酶的催化反应如下：Ribose(Deoxyribose)-purine(1)+Pi→Ribose(Deoxyribose)-1-Pi+purine(1)Ribose(Deoxyribose)-1-Pi+purine(2)→Ribose(Deoxyribose)-purine(2)+Pi嘌呤核苷磷酸化酶的磷酸化反应从热动力学方面来看主要趋向于核苷的合成。嘧啶核苷磷酸化酶的催化反应如下：Ribose(Deoxyribose)-pyrimidine(1)+Pi→Ribose(Deoxyribose)-1-Pi+pyrimidine(1)Ribose(Deoxyribose)-1-Pi+pyrimidine(2)→Ribose(Deoxyribose)-pyrimidine(2)+Pi嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化反应从热动力学方面来看主要趋向于核苷的水解。因此当两种酶同时存在时，就可由嘧啶核苷作为核糖供体合成嘌呤核苷。但是双酶体系要考虑到两种酶的不同酶学性质，同时在一个反应体系中也会存在一定的局限性，而且双酶反应效率远没有单酶反应快。在核苷类似物的合成过程中还存在一个重要的问题：嘌呤类底物溶解性很差，这个问题限制了核苷类似物的大量合成。有研究表明嘌呤类底物溶解度随着温度的增加而增加，提高反应温度可以提高底物反应浓度。针对以上问题，我们拟从实验室菌库出发，获得一种核苷磷酸化酶高产菌株，此菌株可高产一种新的核苷磷酸化酶，此酶应该具有以下几个性质：(1)同时具有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的活性。(2)具有很高的热稳定性。使用此新型的核苷磷酸化酶作为生物催化剂，嘧啶类核苷作为核糖供体，2，6-二卤代嘌呤核苷作为核糖受体，在较高温度的反应体系中实现嘧啶核苷向2，6-二卤代嘌呤核苷的转化。
技术实现思路
为克服上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种核苷磷酸化酶高产菌株，产生的核苷磷酸化酶能够用于高效制备核苷类似物。为了实现本专利技术的上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株核苷磷酸化酶产生菌，分类命名为米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusmigulanus)AM007，其保藏编号为CCTCC：M2016404。本专利技术对米氏硫胺素芽孢杆菌(AneurinibacillusmigulanusAM007)的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌株，杆状细胞，细胞宽度为0.5～1.0μm，芽孢椭圆形，芽孢中生，近中生和亚端生，包囊稍膨大。能够在常规培养基中生长，例如营养琼脂和酪朊大豆琼脂。经16SrDNA序列分析，该菌株鉴定为米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusmigulanus)。本专利技术的另一目的是提供利用上述菌株生产的核苷磷酸化酶及其编码基因，该酶能够用于高效制备核苷类似物。为实现本专利技术的第二目的，本专利技术进一步分离克隆到米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusmigulanus)AM007菌株所产核苷磷酸化酶的编码基因，全长813个碱基，其核苷酸序列具体如SEQIDNO：1所示。该酶具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusmigulanus)AM007菌株所产核苷磷酸化酶命名为核苷磷酸化酶NPase。本专利技术构建了核苷磷酸化酶NPase基因的表达载体。它可以通过本领域常规方法将本专利技术核苷磷酸化酶NPase基因连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus migulanus)AM007，保藏编号为CCTCC NO：M2016404。

【技术特征摘要】
1.一种核苷磷酸化酶高产菌株，其分类命名为米氏硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusmigulanus)AM007，保藏编号为CCTCCNO：M2016404。2.一种由权利要求1所述菌株生产的核苷磷酸化酶，其氨基酸序列表如SEQIDNo：2所示。3.编码权利要求2所述的核苷磷酸化酶的基因。4.根据权利要求3所述基因，其特征在于，所述核苷磷酸化酶酶基因的序列如SEQIDNO：1所示。5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体或重组菌。6.权利要求2所述核苷磷酸化酶在合成核苷类似物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用含有核苷磷酸化酶基因的重组菌或所述重组菌的培养物催化合成核苷类似物；或采用所述核苷磷酸化酶催化合成核苷类似物。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，合成核苷类似物反应中，核糖供体为2'-脱氧尿苷或尿苷；核糖受体具有如下所示的结构式：其中X取代基为Cl、NH2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，刘高飞，周有治，储建林，刘柯，张劲松，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32