一种利用培育高产多糖的水母雪莲毛状根细胞系及液体培养毛状根生产雪莲多糖类化合物的方法，该方法涉及如下步骤： 萌发水母雪莲的无菌种子，取其萌发３天苗龄的绿色子叶取子叶柄置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长和壮苗培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养获得苗下端长有实生根；叶片切段为外植体置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌Ｒ１６０１介导的进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片接入延迟筛选和筛选培养基上再培养，选择抗Ｋｍ且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖１－２ｃｍ用于进行液体扩大培养。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种高产多糖的水母雪莲毛状根的培养方法，还包括多糖的分离、提取、制备工艺方法。
技术介绍
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲多糖有清除自由基和抗疲劳的作用。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如雪兔子为大体型的雪莲，产量较大；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲，产量大；水母雪兔子(又称水母雪莲花)为一种小体型的雪莲；三指雪兔子(又称三指雪莲花)也为一种小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrataKar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。野生雪莲中有效成分——多糖类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。然而，通过人工培育解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用细胞培养高产雪莲多糖类化合物这方面的报道。现代生物技术的运用使大规模生产植物次生代谢物成为可能。利用发根农杆菌诱导植物产生的毛状根具有单细胞起源性、激素自主性、生长快速性、遗传稳定性和次生代谢物高量积累性，使其成为成为继植物细胞发酵培养后又一种更具有优势的工业化获得某些有效成分开辟了新途径。目前，国内报道有诱导毛状根成功的中草药大约人参、西洋参、宁夏枸杞、绞股蓝、荞麦、露水草、松蓝、青蒿、长春花、何首乌、丹参、恬楼、栗米草、甘草、膜荚黄芪、银杏、龙胆、毛喉鞘蕊花、少花龙葵、紫果西番莲、桔梗、红豆草、墨旱莲、红豆杉、天山大黄、决明、天仙子、薯蓣、莨菪等23科50余种药用植物，其具体数目正不断增加。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲多糖类化合物这方面的报道。
技术实现思路
为了解决和克服雪莲自然资源的匮乏和由于采集造成对自然资源的破坏。鉴于此，本专利技术的目的在于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根培养方法，从而利用培养的高产多糖的雪莲毛状根达到生产雪莲多糖类化合物的目的。该方法步骤涉及1.水母雪莲转化体系及毛状根细胞系的建立水母雪莲的无菌种子置MS培养基萌发。取3天苗龄的绿色子叶，留2mm左右的子叶柄，置MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培养基上，诱导培养获得丛生苗。丛生苗置MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA培养基，进行单株培养。选用MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L CH+60mg/L KCl培养基时能使苗更健壮。单株移置诱根培养基1/2MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+60mg/L KCl，10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。以在MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+1.5mg/L AgNO3中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在50μmol/l乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸培养过的发根农杆菌R1601介导，进行转化。其外植体于含20mg/L蔗糖的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef光照培养3-5天，弱光培养诱导发根。10天以后有毛状根出现的材料接入筛选培养基含20mg/L蔗糖的1/2MS+500mg/L Cef+100mg/L Km+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L GA3保持弱光培养。两周以后，切下2-5毫米的根尖接入筛选平板含20mg/L蔗糖的1/2MS+300mg/L Cef+80mg/L Km一周以后，切取抗Km根系根尖1-2cm用于进行液体扩大培养。2.雪莲高产多糖毛状根系悬浮液体培养生产多糖类化合物选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。培养基液体N6培养基，如果有菌再生则加入200-500mg/L Cef。培养条件40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次。培养优化蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和多糖积累，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的10-15倍。3.本专利技术的目的还在于提供一种雪莲毛状根培养物多糖类化合物的分离、提取、制备工艺。雪莲细胞培养物置于干燥器中，60℃烘干后，用粉碎机粉碎成20目的粗粉。用石油醚进行脱色、脱脂。然后，加入蒸馏水，98℃水浴中连续加热浸提15h。真空抽滤，将滤液收集起来，4℃保存。同理在滤渣中再加入0.5M的NaOH溶液，98℃水浴中继续浸提5h，抽滤，收集滤液，4℃保存。将所得滤液减压浓缩至原体积的1/5，加入10％醋酸铅进行沉淀，除去酚性物质、蛋白质、鞣质等杂质，用10％Na2SO4除去多余的铅离子。再加入4％活性炭(m/v)，60℃下水浴脱色1小时。加入无水乙醇、丙酮反复沉淀，离心，低温真空干燥，得到多糖。我们通过发根农杆菌R1601诱导水母雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10-25倍，干燥毛根中所测的总多糖含量最高达毛状根干重的5--10％，比野生生药的0.5％有显著的提高。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲多糖化合物这方面的报道。雪莲为国家保护植物，利用植物毛状根大量培养生产雪莲多糖类化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。本专利技术较与已有技术相比具有如下优点及积极效果(1)雪莲为国家保护植物，利用植物细胞大量培养生产雪莲多糖化合物，走工业化生产的途径，可有限地保护野生资源，保护生态环境。(2)应用细胞大量培养生产多糖类化合物，与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。(3)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。(4)通过人工调节与控制细胞的生长和次生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵德修，杨睿，付春祥，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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