一种培养水母雪莲毛状根生产雪莲黄酮类有效成份的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用雪莲毛状根细胞系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法涉及如下步骤：取其萌发３天苗龄的绿色子叶置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长和壮苗培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根的苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导的进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片接入延迟筛选和筛选培养基上再培养，选择抗Ｋｍ且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖１－２ｃｍ用于进行液体扩大培养，培养物用于干燥、粉碎、有机溶剂分离、提取制备雪莲黄酮类化合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种高产黄酮的雪莲毛状根的培养方法，还包括黄酮的分离、提取、制备工艺方法。
技术介绍
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如雪兔子为大体型的雪莲，产量较大；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲，产量大；水母雪兔子(又称水母雪莲花)为一种小体型的雪莲；三指雪兔子(又称三指雪莲花)也为一种小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。野生雪莲中有效成分——黄酮类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。现代生物技术的运用使大规模生产植物次生代谢物成为可能。利用发根农杆菌诱导植物产生的毛状根具有单细胞起源性、激素自主性、生长快速性、遗传稳定性和次生代谢物高量积累性，使其成为成为继植物细胞发酵培养后又一种更具有优势的工业化获得某些有效成分开辟了新途径。目前，国内报道有诱导毛状根成功的中草药大约人参、西洋参、宁夏枸杞、绞股蓝、荞麦、露水草、松蓝、青蒿、长春花、何首乌、丹参、恬楼、栗米草、甘草、膜荚黄芪、银杏、龙胆、毛喉鞘蕊花、少花龙葵、紫果西番莲、桔梗、红豆草、墨旱莲、红豆杉、天山大黄、决明、天仙子、薯蓣、莨菪等23科50余种药用植物，其具体数目正不断增加。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是，由于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养方法有相当的难度，所以目前尚未见到有关用雪莲毛状根培养生产雪莲黄酮类化合物这方面的报道。
技术实现思路
为了解决雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养技术难题和克服雪莲自然资源的匮乏和由于采集造成对自然资源的破坏，本专利技术的目的在于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养方法，从而利用培养的高产黄酮的雪莲毛状根达到产业化生产雪莲黄酮类化合物的目的。该方法步骤涉及1.水母雪莲转化体系及毛状根细胞系的建立水母雪莲的无菌种子置MS培养基萌发。取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置MS+BA(2.0mg/l)+NAA(0.1mg/l)培养基上，诱导培养获得丛生苗。丛生苗置MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.5mg/l)培养基，进行单株培养。选用MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.2mg/l)+CH(200mg/l)+KCI(60mg/l)培养基时能使苗更健壮。单株移置诱根培养基(1/2MS+IAA(1.0mg/l)+NAA(0.5mg/l)+KCl(60mg/l))，10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。以在MS+2，4D(1.0mg/l)+BA(0.2mg/l)+Ag(1.5mg/l)中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在乙酰丁香酮(As50vM/l)和脯氨酸(250mg/l)培养过的发根农杆菌(R1601)介导，进行转化。其外植体于1/2MS(蔗糖20mg/l)+GA3(0.5mg/l)+Cef(500mg/l)光照培养3-5天，弱光培养诱导发根。10天以后有毛状根出现的材料接入筛选培养基1/2MS(20mg/)+Cef(500mg/l)+Km(100mg/l)+IAA(0.5-1.0mg/l)+NAA(0.5mg/l)+GA(0.5mg/l)保持弱光培养。两周以后，切下2-5毫米的根尖接入筛选平板1/2MS(20mg/)+Cef(300mg/l)+KM(80mg/l)一周以后，切取抗Km根系根尖1-2cm用于进行液体扩大培养。2.雪莲高产黄酮毛状根系悬浮液体培养生产黄酮类化合物选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。培养基液体N6培养基(“朱自清等，1975中国科学，5，484-490”，)如果有菌再生则加入Cef200-500mg/L。培养条件40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次。培养优化蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和黄酮积累，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的10-15倍。3.本专利技术的目的还在于提供一种雪莲毛状根培养物黄酮类化合物的分离、提取、制备工艺。取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干后，以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用有机溶剂能够得到总黄酮类化合物的分离、提取、制备，优选70％乙醇提取，或直接用新鲜的毛状根培养物浸泡于70％酒精中，进行总黄酮类的提取。本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的10-15％，总黄酮生产率为2～3g/升。我们通过发根农杆菌R1601诱导水母雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10-25倍，干燥毛根中所测的总黄酮含量最高达毛状根干重的12％，比野生生药的0.5％有显著的提高。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲黄酮类化合物这方面的报道。雪莲为国家保护植物，利用植物毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物，走工业化生产的途径，可保护有限的野生资源，保护生态环境。本专利技术与已有技术相比具有如下优点及积极效果(1)应用雪莲毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。(2)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。(3)通过人工调节与控制毛状根的生长和次生产物的合成；可极大地提高黄酮类化合物的产量(4)该项技术，不使用光照，在暗中进行毛状根培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低。附图说明图1水母雪莲的再生苗图2 R1601第二次活化生长曲线 注第2次活化接种按2％加入4℃下的保存菌液图3发根农杆菌R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用培育雪莲毛状根系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法涉及如下步骤：　　　　萌发水母雪莲的无菌种子，取其萌发３天苗龄的绿色子叶（留２ｍｍ左右的子叶柄）置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长和壮苗培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；　　　　有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌（Ｒ１６０１）介导的进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片接入延迟筛选和筛选培养基上再培养，选择抗Ｋｍ且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖１－２ｃｍ用于进行液体扩大培养，培养物用于分离、提取制备雪莲黄酮类化合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵德修，陈亚琼，付春祥，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]