一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法及应用，属于茶叶检测领域，具体步骤包括：以茶样为原材料采用化学提取方法获得供试品溶液；流动相以体积比为0.3～1.2％乙酸水溶液为A相、以乙腈为B相进行梯度洗脱。本发明专利技术建立的HPLC法可以同时测定茶叶中黄酮类的六种成分，包括三种黄酮苷和三种黄酮醇，提高了黄酮类成分的总含量的测定，以及对研究茶叶品质及其控制有重要的意义。

Method for determination of flavonoids in tea by HPLC

The invention discloses a method for the determination and application of flavonoids in tea by HPLC, which belongs to the field of tea detection, the concrete steps include: raw materials by chemical extraction method in tea samples for the test solution; the mobile phase with a volume ratio of 0.3 to 1.2% acetic acid aqueous solution for the A phase, with acetonitrile as B phase gradient elution. The HPLC method established by the invention can simultaneous determination of six flavonoids in tea, including three flavonoid glycosides and three flavonols, improve the determination of total flavonoid content, has important significance to study and the quality of tea and its control.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种茶叶的检测方法，尤其涉及一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法及应用。
技术介绍
黄酮类是广泛存在于自然界中的一类黄色色素，也称花黄素。其基本结构式2-苯基色原酮。现泛指2个具有酚羟基的苯环通过中间三碳链接而成的具有C6-C3-C6碳架的一大类低分子量的多酚类化合物。根据黄酮类化合物中心C环的不同修饰，可分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、异黄酮、黄烷酮和花青素等几大类，其中以黄酮醇类种类最多，占黄酮类化合物总数的1/3左右。黄酮及其苷类具有多种生理功能，研究表明具有抗氧化、预防心血管疾病、防癌及保护肝脏等作用。茶叶中含有大量的黄酮苷类物质，以黄酮醇苷为主，主要为槲皮素苷、杨梅素苷及山奈酚苷；少部分以黄酮醇苷元形式存在，即槲皮素、杨梅素和山奈酚。茶树品种、生长气候、加工工艺、贮藏条件等对茶叶中黄酮醇苷类物质的分布和含量均有一定的影响。黄酮醇苷类物质还是茶汤涩味和色泽形成的重要因子，与茶叶品质密切相关。公布号为CN103380837A的中国专利公开了提取茶叶有效成分的方法主要有传统提取法和现代提取法，其中，传统提取法主要有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取法；现代提取方法主要有超声提取技术、微波提取技术、超微粉碎辅助提取技术、超临界流体萃取和生物酶解提取技术。这些提取技术采用的溶剂大多数是氯仿、甲醇等有机溶剂，而有机溶剂存在对环境造成污染的问题。离子提取液-超声辅助提取技术中的离子提取液为一种新型的绿色溶剂，具有不挥发、溶解性强等特性，目前在有机合成、天然植物萃取等方面得到广泛应用，代替了易挥发、有毒有机溶剂的替代品，使环境友好、成本低，而超声辅助萃取可以减少植物的萃取时间。因此两者结合的提取方法为本专利技术提取茶叶中黄酮类成分提供了有效的思路。目前，利用高效液相色谱HPLC检测茶叶中黄酮类的成分大多数为山奈素、槲皮素、杨梅素或槲皮苷，但是还没将包括山奈素、槲皮素、杨梅素、及其苷类芸香苷、槲皮苷、山奈苷六种成分同时测定的报道。例如，公布号为CN104330482A的专利公开了一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其中，检测的黄酮成分包括槲皮素和山奈素。文献“不同茶树品种中黄酮苷含量的测定”报道了采用液相质谱技术分离、鉴定了茶叶中的12种黄酮苷类化合物，包括1种芹菜素苷、2种杨梅素苷、5种槲皮素苷和4种山奈酚苷。终上所述，本专利技术利用HPLC同时测定茶叶中六种黄酮类成分，对研究茶叶品质及其控制有重要的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法，所述方法包括如下步骤：以茶样为原材料采用化学提取方法获得供试品溶液；流动相以体积百分比为0.3～1.2％乙酸水溶液为A相、以乙腈为B相进行梯度洗脱；其中所述梯度洗脱过程中，7min或以内，流动相中A相的体积百分比为80-90％，7分钟后25min以内，流动相中A相占比下调但保持在70％以上；或者，所述梯度洗脱过程中，7min或以内，流动相中A相的体积百分比为84-88％，7分钟后25min以内，流动相中A相占为74-85％。优选，所述梯度洗脱过程为：0-7min，86.0％-84.5％A相；7-15min，84.5％-82.5％A相；15-20min，82.5％-76.0％A相；20-25min，76.0％-75.0％A相；25-35min，75.0％-62.0％A相；35-36min，62.0％-86.0％A相；36-42min，86.0％A相；或者，所述梯度洗脱过程为：0-7min，87.0％-84.5％A相；7-15min，84.5％-81.5％A相；15-20min，81.5％-75.0％A相；20-25min，75.0％-75.0％A相；25-35min，75.0％-68.0％A相；35-42min，68.0％-87.0％A相。根据上述方法，优选，其中流动相以体积百分比为0.3-0.8％乙酸水溶液为A相、以乙腈为B相进行梯度洗；更优选地，以体积百分比为0.3-0.5％乙酸水溶液为A相。在一个优选的实施例中，以体积百分比为0.4％乙酸水溶液为A相。根据上述方法，其中，所述的化学提取方法包含70％甲醇回流提取法、纯甲醇回流提取法或离子提取液-超声辅助提取法，优选的，离子提取液-超声辅助提取法。根据上述的方法，其中，所述的离子提取液-超声辅助提取法为将所述茶样与离子提取液混合，超声，离心，过滤。根据上述的方法，其中，所述离子提取液选择为1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐或氯化1-丁基-3-甲基咪唑，优选为1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐。根据上述的方法，其中，所述茶样与所述离子提取液的质量体积比为0.1g～0.4g：10mL，优选的，0.1g:10mL。根据上述的方法，其中，所述离子提取液的浓度为0.3mol/L～1.8mol/L，优选的，1.2mol/L。一种根据上述的方法在检测绿茶、红茶或普洱茶中黄酮类成分的应用。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：(1)仪器方法优化：不仅同时成功检测出茶叶中含量较高的六种黄酮类成分，包括三种黄酮醇：山奈素、槲皮素、杨梅素；三种黄酮苷：芸香苷、槲皮苷、山奈苷，还成功将山奈苷、槲皮素、杨梅素分离成独立峰形，除去杂质的干扰；(2)标准曲线的绘制：优化了各组分的浓度梯度，使含量较低的山奈苷能够被检出，不仅增加了黄酮类成分的种类，而且加大了黄酮类物质含量的测定结果，使结果更精确；(3)提取方法的选择：确定了最佳黄酮类成分的提取方法，增加了黄酮各组分的提取效果，加大了提取效率，降低提取时间，使方法更快捷方便，同时采用离子提取液作为萃取剂使该检测方法环境友好，成本低；(4)茶样与离子提取液配比的选择：选择了最佳料液比，使茶叶中的黄酮类成分的提取效率增加；(5)离子提取液浓度的选择：选择了最合理的离子浓度，降低试剂的浪费，优化了提取的效果；(6)经对绿茶、红茶与普洱茶进行检测，拓宽了该方法的使用范围。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。附图说明图1为实例1洗脱条件1茶样谱图；图2为实例1洗脱条件2茶样谱图；图3为实例1洗脱条件3茶样谱图(仅作为对比)；图4为实例2重复性实验谱图；图5为实例2精密度实验谱图；图6为实施例3为红茶HPLC谱图；图7为实施例3绿茶谱图；图8为实施例3普洱茶谱图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，下面通过具体实施例对本专利技术的方法进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。详细说明如下：Waters2695分离单元；2489紫外检测器；在线脱气器；自动进样器；WatersSunfireC185μm4.6×150mmColumn色谱柱；WatersEmpower工作站；振荡器；分析天平(感量0.0001g)；离心机本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以茶样为原材料采用化学提取方法获得供试品溶液；流动相以体积百分比为0.3～1.2％乙酸水溶液为A相、以乙腈为B相进行梯度洗脱；其中所述梯度洗脱过程中，7min或以内，流动相中A相的体积百分比为80‑90％，7分钟后25min以内，流动相中A相占比下调但保持在70％以上。

【技术特征摘要】
1.一种利用HPLC测定茶叶中黄酮类成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以茶样为原材料采用化学提取方法获得供试品溶液；流动相以体积百分比为0.3～1.2％乙酸水溶液为A相、以乙腈为B相进行梯度洗脱；其中所述梯度洗脱过程中，7min或以内，流动相中A相的体积百分比为80-90％，7分钟后25min以内，流动相中A相占比下调但保持在70％以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中，7min或以内，流动相中A相的体积百分比为84-88％，7分钟后25min以内，流动相中A相占为74-85％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：0-7min，86.0％-84.5％A相；7-15min，84.5％-82.5％A相；15-20min，82.5％-76.0％A相；20-25min，76.0％-75.0％A相；25-35min，75.0％-62.0％A相；35-36min，62.0％-86.0％A相；36-42min，86.0％A相；或者，所述梯度洗脱过程为：0-7min，87.0％-84.5％A相；7-15min，84.5％-81.5％A相；15-20min，81.5％-75.0％A相；20-25min，75.0％-75.0％...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌登猛，陈孝权，于星，
申请(专利权)人：勐海茶业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53