一种信号分子N‑Heptanoyl‑L‑homoserine lactone的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种信号分子N‑Heptanoyl‑L‑homoserine lactone的检测方法，本方法主要包括以下步骤：提取适量水样，离心分离后过膜处理，选择合适的萃取剂，采用漩涡混合器混合，准备合适的分液漏斗分离，利用旋转蒸发仪提纯，再经过膜处理后，采用连接UV检测器的高效液相色谱仪对信号分子N‑Heptanoyl‑L‑homoserine进行检测，有机流动相比例为65％，无机流动相比例为35％，反应系统的样品流速设定为0.25ml/min，进样量设定为10μl，色谱柱选择为反相色谱柱，UV监测器的监测波长设定在210nm。本发明专利技术所述检测方法具有简便，快捷，精准，稳定，回收率高等特点。

A detection method of signal molecule N Heptanoyl L homoserine lactone

The present invention provides a method for detecting N Heptanoyl L signal molecule homoserine lactone, this method mainly comprises the following steps: extracting the appropriate amount of water, centrifugal separation after film processing, the selection of a proper extraction solvent, using the vortex mixer, prepare a separatory funnel suitable separation, purification by rotary evaporation apparatus. After film processing, chromatography on N Heptanoyl L signal molecules homoserine connected by high performance liquid UV detector, organic mobile phase ratio of 65%, inorganic mobile phase ratio is 35%, the sample flow rate of reaction system is set to 0.25ml/min, sample volume is set to 10 L, the column selection column UV monitor monitoring wavelength set at 210nm. The detection method of the invention has the advantages of simplicity, convenience, accuracy, stability and high recovery rate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，特别涉及一种采用UV检测器的高效液相色谱技术检测信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的方法。
技术介绍
细菌能自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其在环境中浓度变化，调节微生物的群体行为，这一调控体系称为群体感应。细菌群体感应参与包括人类、动植物病原茵致病力在内的多种生物学功能的调节。许多细菌都能合成并释放一种被称为自诱导物质AI的信号分子，胞外环境中的AI浓度能随细菌密度的增加而增加，达到一个阈值时，AI能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为。如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等。因此近年来对于群体感应信号分子的研究尤为突出，建立了许多基于群体感应调控细菌行为的机制。在测定环境中信号分子时，需要浓缩所采样本的浓度，而在此过程中会产生较大误差。N-Heptanoyl-L-homoserinelactone是一种不常见的革兰氏阴性菌群体感应信号分子，常被用于测定革兰氏阴性菌群体感应信号分子的内标信号分子，其分子式为C11H19NO3，分子量213.97，常见缩写为C7-HSL，结构式为：目前尚未有检测N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的方法。为此建立一种N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法十分重要。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，实现最高效的分离和检测，且方法简单，快捷，回收效率高。为实现上述目的，本专利技术提供了一种信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：步骤一、选取适量样品，进行离心分离，取上清液经过滤膜过滤作为待测液，采用等体积萃取剂，使样品与萃取剂进行均匀混合；步骤二、对样品混合液进行分离，将分离的萃取剂作为第一浓缩待测液，将上清液作为萃取待测液；步骤三、采用与萃取待测液等体积的萃取剂再次与萃取待测液均匀混合，对上述二次混合液分离，将分离后的萃取剂作为第二浓缩待测2，将第一浓缩待测液和第一浓缩待测液混合作为待浓缩样品；步骤四、浓缩待浓缩样品，浓缩后采用有机溶液提取，得到提取液；步骤五、将所述提取液采用滤膜过滤，得到待测样品；步骤六、利用连接UV检测器的高效液相色谱仪对待测样品中的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone进行检测。优选的，采用等体积乙酸乙酯作为萃取剂。优选的，所述步骤一中的混合时间为30s-5min；优选的，在所述步骤二中，分离时间为1-60min。优选的，在上述步骤中的分离与混合时，均利用涡旋混合器对溶液进行均匀混合，均利用分液漏洞分离对溶液进行分离。优选的，在所述步骤四中，利用旋转蒸发仪进行浓缩，采用1-2ml乙腈溶液(乙腈：水＝65：35)作为提取液。优选的，所述步骤一中的滤膜为0.45μm滤膜，所述步骤五种的滤膜为0.22μm滤膜。优选的，在所述步骤六中，对高效液相色谱仪的有机流动相乙腈设定比例为65％，无机流动相超纯水的比例设定为35％，流速设定为0.25ml，进样量设定为10μl，色谱柱选择为反相色谱柱C18，UV监测器的监测波长设定在210nm。本专利技术的上述技术方案的有益效果在于：1.提出一种简单常规的采用高效液相色谱检测信号分子的方法；2.前处理的方法简单，快捷，回收效率高；3.通过设定高效液相色谱参数，选择合适的流速、流动相、流动相比例和检测波长，使样品中的N‐Heptanoyl‐L‐homoserinelactone得到最高效的分离和检测。附图说明图1是本专利技术具体实施方式中检测N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的色谱图；图2是本专利技术具体实施方式中检测N-Heptanoyl-L-homoserinelactone标准曲线图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本专利技术提供了一种信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：步骤一、选取适量样品，进行离心分离，取上清液经过滤膜过滤作为待测液，采用等体积萃取剂，使样品与萃取剂进行均匀混合；步骤二、对样品混合液进行分离，将分离的萃取剂作为第一浓缩待测液，将上清液作为萃取待测液；步骤三、采用与萃取待测液等体积的萃取剂再次与萃取待测液均匀混合，对上述二次混合液分离，将分离后的萃取剂作为第二浓缩待测2，将第一浓缩待测液和第一浓缩待测液混合作为待浓缩样品；步骤四、浓缩待浓缩样品，浓缩后采用有机溶液提取，得到提取液；步骤五、将所述提取液采用滤膜过滤，得到待测样品；步骤六、利用连接UV检测器的高效液相色谱仪对待测样品中的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone进行检测。以甲醇为配制标准溶液的溶剂，配制信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone标准溶液，高效液相色谱连接UV检测器，所采用试剂均为色谱纯。高效液相色谱中的有机流动相设定为乙腈，比例为65％；无机相为超纯水，比例设定为35％；反应系统的样品流速设定为0.25ml/min；进样量设定为10μl，色谱柱选择为反相色谱柱C18，UV监测器的监测波长设定在210nm。计算机系统记录色谱图形，以目标物的峰面积作为目标物的响应值，对样品进行分析。按照上述条件及方法进行高效液相色谱仪和UV检测器(HPLC-UV)分析检测。准确提取50ml水样于50ml旋盖离心管内，向其中加入一定量的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone，使水样中的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone浓度达到10mg/L左右，对混合的水样在8000rpm下离心20min，取上清液经过0.45μm滤膜过滤，将滤出样放入旋盖玻璃瓶中，想其中加入50ml分析纯乙酸乙酯，旋紧瓶盖。将玻璃瓶置于漩涡混合器上进行混合1min，后将混合液倒于分液漏斗内分液处理，储备分离后的乙酸乙酯溶液。如此再操作一次，合并分离后的乙酸乙酯至150ml圆底烧瓶内，设定旋蒸仪的温度为45℃，将乙酸乙酯蒸干后，采用1ml乙腈溶液(乙腈：水＝65：35)提取，将提取液通过0.22μm滤膜，放入棕色液相色谱瓶中，采用HPLC-UV对其测定。对水样做了五个平行样品，样品编号分别为a1，a2，a3，a4和a5，分析结果见表1，并且对第一个平行样品a1进行了5次重复测定，其测定及分析结果见表2。由表1知平行样品的标准差为0.11，相对标准偏差为1.13％。由表2知重复性测试的标准差为0.05，相对标准偏差为0.51％。将定量的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone样品加入到上述的水样中，选择与上述相同的实验方法、溶剂、处理方法和仪器条件进行实验。做五组加标含量，每个加标含量的样品做3次平行测定后取平均值，根据实际加入量和实际结果，计算五组加标样品的加标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种信号分子N‑Heptanoyl‑L‑homoserine lactone的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：步骤一、选取适量样品，进行离心分离，取上清液经过滤膜过滤作为待测液，采用等体积萃取剂，使样品与萃取剂进行均匀混合；步骤二、对样品混合液进行分离，将分离的萃取剂作为第一浓缩待测液，将上清液作为萃取待测液；步骤三、采用与萃取待测液等体积的萃取剂再次与萃取待测液均匀混合，对上述二次混合液分离，将分离后的萃取剂作为第二浓缩待测2，将第一浓缩待测液和第一浓缩待测液混合作为待浓缩样品；步骤四、浓缩待浓缩样品，浓缩后采用有机溶液提取，得到提取液；步骤五、将所述提取液采用滤膜过滤，得到待测样品；步骤六、利用连接UV检测器的高效液相色谱仪对待测样品中的N‑Heptanoyl‑L‑homoserine lactone进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：步骤一、选取适量样品，进行离心分离，取上清液经过滤膜过滤作为待测液，采用等体积萃取剂，使样品与萃取剂进行均匀混合；步骤二、对样品混合液进行分离，将分离的萃取剂作为第一浓缩待测液，将上清液作为萃取待测液；步骤三、采用与萃取待测液等体积的萃取剂再次与萃取待测液均匀混合，对上述二次混合液分离，将分离后的萃取剂作为第二浓缩待测2，将第一浓缩待测液和第一浓缩待测液混合作为待浓缩样品；步骤四、浓缩待浓缩样品，浓缩后采用有机溶液提取，得到提取液；步骤五、将所述提取液采用滤膜过滤，得到待测样品；步骤六、利用连接UV检测器的高效液相色谱仪对待测样品中的N-Heptanoyl-L-homoserinelactone进行检测。2.根据权利要求1所述的信号分子N-Heptanoyl-L-homoserinelactone的检测方法，其特征在于，采用等体积乙酸乙酯作为萃取剂。3.根据权利要求1所述的预处理强化剩余污泥厌氧发酵产酸的方法，其特征在于，所述步骤一中的混合时间为30s-5min。4.根据权利要求1所述的信号分子N-Hept...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭婉茜，冯骁驰，任南琪，郑禾山，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23