溶瘤病毒制造技术

本发明专利技术涉及用于癌症治疗的溶瘤痘苗病毒和病毒载体，其中该病毒包括位置取向相同的至少三个痘苗病毒启动子。

Oncolytic virus

The invention relates to an oncolytic vaccinia virus and viral vectors for cancer therapy, the virus including at least three position of the same promoter of vaccinia virus.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】溶瘤病毒
本专利技术涉及癌症治疗。特别地，本专利技术涉及用于癌症治疗的溶瘤性痘苗病毒和病毒载体。
技术介绍
尽管微创手术、超分割放疗和化疗药物新组合方面取得了进展，但是许多类型的实体瘤患者的存活率仍保持不变。溶瘤病毒是治疗对常规治疗有抗性的癌症的一种有吸引力的治疗剂。溶瘤病毒是能够特异性靶向并杀死癌细胞的病毒。此外，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号。痘苗病毒是双链DNA病毒，其具有许多使其具有溶瘤治疗吸引力的候选项的特征。其能够快速复制，有效扩散到肿瘤以及强溶解能力。此外，痘苗已经得到广泛研究，并且具有被清楚理解的分子生物学，具有高克隆能力和多种商业可用的天然和合成启动子，使其成为携带异源核酸序列的载体的理想选择。痘苗具有良好的安全性，并且容易获得对不受控制的感染的治疗。此外，通常在实体瘤中发现的缺氧微环境，不利于许多类型的溶瘤病毒的复制和发挥功效，但不会对痘苗病毒的复制和功效不利。已报道了溶瘤痘苗病毒的几种菌株，例如WesternReserve，Wyeth和Lister菌株。已经创建了每一种所述菌株的各种缺失突变体。McCart等人(CancerRes.2001,61；8751-8757)描述了一种在胸苷激酶(TK)基因和病毒生长因子(VGF)基因中具有缺失的WesternReserve(WR)株。这些缺失突变体能够有效地交叉触发针对肿瘤抗原的免疫系统。然而，生物分布研究表明，其在正常卵巢组织中具有显著病毒滴度而在骨髓中则较小，提高了痘苗病毒治疗后发生不育和骨髓抑制的预期。Hung等人(GeneTherapy,2007,14；20–29)描述了一种TK缺陷型痘苗Lister菌株。然而，观察到该菌株还在卵巢肿瘤之外的正常卵巢中定位。将异源基因例如细胞因子编码基因插入病毒中，可以进一步驱动免疫应答。然而，细胞因子的插入可以通过早期病毒清除来降低病毒复制功效。这确实已用”武装”有一些免疫调节基因如IL-2，IL-15，TNF和CD40配体的痘苗病毒在体内观察到。尽管溶瘤病毒领域已经取得了进展，但是市场上尚无基于痘苗的治疗产品。因此，需要更有效的溶瘤性痘苗来治疗癌症。
技术实现思路
本专利技术提供改进的溶瘤性痘苗病毒。本申请的专利技术人惊奇地发现，在肿瘤组织中，具有失活的N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒株显示出比现有技术更强的选择性和抗肿瘤功效。本专利技术还提供了痘苗病毒载体。具体实施方式本专利技术的第一方面提供了包含至少三种痘苗病毒启动子的核酸序列，其中所述至少三种启动子以相同取向位于核酸序列中。线性DNA具有两种可能取向：5'至3'方向和3'至5'方向。例如，如果一个启动子位于5'至3'方向，并且如果第二启动子也位于相同多核苷酸分子/链内的5'至3'方向，则两个启动子的位置具有相同取向。核酸序列可以是天然的、合成的或重组的。它可以是例如cDNA、PCR产物或基因组序列。其可以是分离的，或作为质粒、载体或宿主细胞的一部分。质粒是具有独立于染色体DNA复制的能力的环状染色体外DNA分子。质粒可用于将表达盒导入宿主细胞。质粒也可以用于在宿主细胞中表达多肽。例如，可以用能够编码特定多肽的质粒转染细菌宿主细胞，以便表达该多肽。该术语还包括能够容纳DNA更长部分的酵母人工染色体和细菌人工染色体。启动子是具有可启动特定基因转录的特异性序列的DNA区域。用于在痘苗中表达异源基因的启动子，包括控制早期和晚期转录活性的启动子，例如mH5、H5、P7.5和PE/L。本申请所述的异源基因，是病毒中通常不存在的基因。修饰的H5启动子(mH5)主要具有早期活性，且具有比天然存在的H5更高的稳定性。优选地，所述至少三个启动子是mH5。在本专利技术的优选实施例中，启动子包含与图1所示序列基本上同源的核苷酸序列。具有大于20％一致性(例如25％，30％，40％，50％60％，70％，80％，90％，95％或99％)则认为是同源序列。如本申请所述，基本上同源是指表现出至少60％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，96％，97％，98％，99％％或更高的一致性。在本专利技术的一个实施例中，所述序列与如图1中所示的序列集具有至少80％或更高(例如，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％等)的一致性。如本申请所使用的术语同源性和一致性是可互换的。用于确定同源性的序列比较，可以使用容易获得的序列比较软件来进行。示例包括但不限于BLAST(参见Ausubeletal.,1999ShortProtocolsinMolecularBiology,4thEd-第18章)和FASTA((Altschuletal.,1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubeletal.,1999,ShortProtocolsinMolecularBiology，第7-58至7-60页)。在第一方面的一个实施例中，核酸序列存在于载体中。如本申请所述的载体是指，用于将核酸序列引入细胞或病毒中以进行表达或复制的构建体。其是指重组构建体，例如质粒、病毒或能够在引入细胞或病毒后表达或复制核酸序列的任何其它构建体。第一方面的核酸序列可以是表达盒的一部分。表达盒是载体的一部分。其包含启动子、开放阅读框和3'非翻译区。在本专利技术的一个实施例中，痘苗病毒载体包含与图2所示序列具有至少80％或更高(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同源性的核苷酸序列。在本专利技术的另一个实施例中，核酸序列编码异源多肽。本申请所述的多肽，是指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。其可与蛋白质、肽、寡肽互换使用，并且包括糖蛋白及其衍生物。术语“多肽”还旨在涵盖保有与原始多肽相同生物学功能或活性的多肽类似物和衍生物。如本申请所述的异源多肽是指，通常不由天然病毒表达的任何多肽。异源多肽可以是生物活性的。如本申请所述的生物活性多肽，是指具有生物学功能或活性的多肽。在本专利技术的一个实施例中，生物活性多肽是治疗性的。治疗性多肽是已经或正在开发的用于治疗用途的多肽。治疗性多肽的示例包括但不限于细胞因子，趋化因子和生长因子。细胞因子可以是免疫调节剂，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36)、干扰素(INF-α、INF-β、INF-γ和INF-ω)、肿瘤坏死因子(TNF)和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在本专利技术的一个实施例中，多肽是白细胞介素。在本专利技术的优选实施例中，多肽是IL-12。IL-12可以来自任何动物，例如人(hIL-12)、小鼠(mIL-12)、马、牛、猪等。它可以是天然的或重组的。优选地，编码IL-12的核苷酸序列是全长IL-12基因。在其它实施例中，核苷酸序列编本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含至少三个痘苗病毒启动子的核酸序列，其中所述至少三个启动子的位置具有相同取向。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.01 GB 1405834.11.包含至少三个痘苗病毒启动子的核酸序列，其中所述至少三个启动子的位置具有相同取向。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述启动子是在所述病毒生命周期的早期和/或晚期具有活性的启动子。3.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述启动子选自mH5、H5、P7.5和PE/L。4.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码异源性多肽。5.根据权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述多肽为细胞因子。6.根据权利要求5所述的核酸序列，其特征在于，所述细胞因子选自GM-CSF、IL-12和IL-21。7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含一个或多个限制性位点。8.根据权利要求7所述的核酸序列，其特征在于，所述一个或多个限制性位点选自SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI。9.根据权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述多肽为报告子多肽。10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括与如图1所示的核酸序列基本同源的序列。11.包含根据权利要求1至10中任一项所述的核酸序列的痘苗病毒载体。12.包含根据权利要求1至11中任一项所述的载体或核酸序列的痘苗病毒，其中所述载体或核酸序列插入到N1L基因内。13.包含失活N1L基因的TK缺乏型痘苗病毒。14.根据权利要求13所述的TK缺乏型痘苗病毒，其特征在于，通过插...

【专利技术属性】
技术研发人员：王尧河，袁明，贾汉吉尔·艾哈迈德，尼古拉斯·罗伯特·勒莫因，
申请(专利权)人：玛丽女王伦敦大学，
类型：发明
国别省市：英国,GB