人工抗原的制备－一半抗原与蛋白质交联的新方法技术

本发明专利技术涉及一种新型的人工抗原的合成方法，将半抗原（主要是指含磷化合物）先键合在Ｌ－赖氨酸或多肽上制成磷酰化赖氨酸或多肽酸，再用缩合试剂ＥＤＣＰ与Ｎ－羧基琥珀酰亚胺反应制备出活化酯，最后在水体系中与蛋白质载体交联，此方法操作简便，易于掌握，收率较高，适合于含磷化合物半抗原与蛋白质的交联，也可推广到其它类型半抗原的交联。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用新型的桥结构L-赖氨酸或多肽及新型有机磷缩合试剂将有机磷化合物半抗原与载体分子(蛋白质)交联的制备人工抗原的方法，属生物有机大分子的制备
在化学免疫及有关研究领域中为使无免疫原性的小分子物质(通常称为半抗原，Hapten)能在动物体内诱发产生抗体，常要将这种半抗原与某种大分子载体如蛋白质、多肽、或多糖等经化学交联共价结合而成为人工抗原。将人工抗原作为免疫原注射到动物体内会诱发产生抗体。这种抗体经过提纯后做为疫苗注入人体或动物体后，即可抗某种药物或病毒，这种过程叫化学免疫，它是当前医学、药理及生物工程研究(催化抗体)中最活跃的领域之一。化学免疫中的关键就是人工抗原的制备，过去关于此方面的报导较多，比较成熟的交联方法包括重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法、卤代硝基苯法等，这些方法缺点在于所采用的桥结构(即半抗原与蛋白质的联结部分)均为人工合成的有机物，有些化合物的结构还会对诱发抗体的产生有一定的影响。近来又发现了一些用多肽做为桥结构进行联接，但所采用的方法比较陈旧，选择的催合剂付产物多，难纯化，方法掌握也比较困难，特别是对于将含磷化合物的半抗原交联到载体分子上，一直是目前在人工抗原制备领域的一个难点。过去的方法多采用重氮化法，最近也有关于用His-Cys做桥结构的报导，但国内有些单位重复实验一直未能成功。将半抗原上的羧基与蛋白质上的侧链氨基交联制备抗原的方法是一种常见的方法，但过去采用的一种是用水溶性脱水剂(EDC)，此方法选择性差，易形成蛋白分子之间的交聚。现逐渐为活泼酯法所代替。活泼酯法就是先将羧基与N-羟基琥酰亚胺缩合制成活泼酯，再与蛋白质分子交联。过去多用二环已基碳酰亚胺(DCC)做为脱水剂，由于生成的付产物DCU很难除去，影响了活化酯的纯度及进一步与蛋白质的交联。本专利技术的目的就是寻找一个适当的桥结构，并选择一条简便、实用、易操作、产率高、纯度好的新型人工半抗原的制备路线，使之适合各类含磷化合物半抗原与载体分子的交联。本专利技术的内容包括1.选择了天然有机物L-赖氨酸做为桥结构。由于它存在于所有生物体内，从而克服了一些人工合成化合物的引入带来的不利影响，它适合各类有机磷半抗原与载体分子的联接，也可用于其它有机物半抗原与载体的交联。2.设计了新型的人工抗原的结构模型，这种模型不仅制备容易，而且具有很强的诱发产生抗体的能力。3.选择了一种新型有机磷的缩合剂如EDCP、DECP、DEPH等及缩合方法及合成路线。人工抗原的合成路线如下 其中X＝烷氧基、烷基、芳香基等Y＝烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧负离子等Z＝H、Cl、Br、F。HOSu＝N-羟基琥珀酰亚胺制备通法一、化合物C的制备首先将L-赖氨酸或多肽b溶解于水～乙醇(二者体积比为1∶1)的溶液中，再加入与L-赖氨酸或多肽b成摩尔比为1∶2-3的三乙胺，冷却至0℃～-5℃。然后将有机磷化合物的半抗源a溶解于有机溶剂如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二氧六环等溶剂中，将该混合溶剂慢慢滴加到上述混合液中，反应2～12小时后，用浓度为1N的无机酸酸化到PH＝3。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯-叔丁醇萃取，干燥，减压浓缩，即得到产物C。二、活泼酯d的制备将上述浓缩物C溶于干燥的乙酸乙酯，或四氯呋喃或二氧六环中，加入与浓缩物C等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，再加入稍过量的三乙胺，冰水冷却下加入缩合剂，缩合剂可为0-乙基二氯磷酸酯(EDCP)，或0.0-二乙基氯磷酸酯(DECP)或二乙基亚磷酯(DEPH)。反应5-12小时后，溶液用弱碱水洗几次后干燥，即得到活泼酯d。三、人工抗原e的制备(即半抗原与蛋白质的交联)将蛋白质(或酶、糖)溶于水和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液中，再加入与蛋白质(或酶、糖)等摩尔的三乙胺。加入由上述第二步制得的活泼酯d，在0℃～-10℃反应过夜，溶液在蒸馏水中于4℃下透析3天，每天换三次水，冷冻干燥，得到固体e人工抗原。本方法可在水体系中直接将半抗原含磷化合物a与桥结构化合物b联接。半抗原可以为各种结构的含磷化合物。实例二异丙基亚磷酸酯即DIP及沙林的人工抗原的制备1.Na、Ne-二(二异丙基磷酰基)L-赖氨酸20mmol(2.92g)L-赖氨酸溶于5ml水，5ml乙醇及8ml三乙胺中，冷至0℃，加入二异丙基亚磷酸酯(DIP，40mmol，6.6g)及5ml四氯化碳，反应2-1小时，除去有机溶剂，水层酸化至PH＝3，用乙酸乙酯萃取，干燥，酸化后除去溶剂即得到无色油状物，重5.2g，产率55%。结构测定分子式C18H40N2P2O831P-NMR(EtOAc) 8.26ppm，6.53ppm1H-NMR(CDC13) δ1.0-1.5(m，30H)，2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)，11.5(s，1H)FAB-MS m/e MH+475元素分析实测值 C 45.88， H 8.38， N 5.85计算值 C 45.56， H 8.44， N 5.912.Na、Ne-二(二异丙基磷酰基)L-赖氨酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯将磷酰化赖氨酸(3.0mmol，1.4g)溶于乙酸乙酯中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.2mmol，0.4g)，常温下加入4ml三乙胺，冷至0℃，滴加0.5g(3.0mmol)EDCP，反应6小时，溶液用饱和碳酸氢钠水溶液洗5次(10ml×5)，再用水洗2次(10ml×2)，有机相用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂得到浅黄色油状物，重1.0g，产率58%。结构测定分子式C22H43N3P2O1031P-NMR(EtOAc) 8.91ppm，6.24ppm1H-NMR(CDC13) δ1.1-1.3(m，30H)，2.0(s，4H) 2.8-2.9(brs，2H)，3.0-3.3(bs，2H)，3.6-3.8(s，1H)，4.3-4.6(m，4H)。FAB-MS m/e MH+5723.磷酰化赖氨酸与牛血清白蛋白(BSA)的交联(DIP-BSA人工抗原)将牛血清白蛋白(BSA，0.3g)溶于8ml水，4ml二甲基甲酰胺(DMF)及4ml三乙胺中，在0-4℃滴加磷酰化赖氨酸N-羧基琥珀酰亚胺酯(0.8g)的5mlDMF，慢慢搅拌16个小时，将溶液装入透析袋中，将入2升蒸馏水中在4℃下透析三天，每天换三次蒸馏水，透析完毕，冷冻干燥，得到固体蛋白(0.3)，于-20℃冷冻保存。31P-NMR(H20) 10.3ppm，8.2ppm4.磷酰化赖氨酸与血兰蛋白(KLH)的交联(DIP-KLH人工抗原)方法同上，得到浅兰色蛋白，低温保存。a1P-NMR(H20) 10.0ppm，8.2ppm化学免疫实验1.免疫过程将人工抗原DIP-KLH分别溶于0.9%的氯化钠水及福氏佐剂(FCA or FIA)中，然后等体积混合乳化后备用。将体重在2.5-3.0Kg的同姓别的新西兰白兔笼养一段时间后，进行五次免疫，第一次在第一天进行，按20mg/Kg体重注射DIP-KLH抗原的FCA乳化液，10天后，进行第二次免疫，从白兔的后脚掌注射0.4mlFIA乳化液(含0.2mgDIP-KLH)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新人工抗原的制备方法，其特征在于该制备方法采用如下合成路线：＊＊＊其中：Ｘ＝烷氧基、烷基、芳香基等Ｙ＝烷氧基、氰基、胺基、羧基、氧负离子等Ｚ＝Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ。ＨＯＳｕ＝Ｎ－羟基琥珀酰亚胺制备通法：一、化合 物Ｃ的制备首先将Ｌ－赖氨酸或多肽ｂ溶解于水～乙醇（二者体积比为１∶１）的溶液中，再加入与Ｌ－赖氨酸或多肽ｂ成摩尔比为１∶２－３的三乙胺，冷却至０℃～５℃。然后将有机磷化合物的半抗源ａ溶解于有机溶剂如四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯呋喃、二 氧六环等溶剂中，将该混合溶剂慢慢滴加到上述混合液中，反应２～１２小时后，用浓度为１Ｎ的无机酸酸化到ＰＨ＝３。最后用乙酸乙酯或乙酸乙酯－叔丁醇萃取，干燥，减压浓缩，即得到产物Ｃ。二、活泼酯ｄ的制备将上述浓缩物Ｃ溶于干燥的乙酸乙酯，或四 氯呋喃或二氧六环中，加入与浓缩物Ｃ等摩尔的Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＨＯＳｕ），再加入稍过量的三乙胺，冰水冷却下加入缩合剂，缩合剂可为０－乙基二氯磷酸酯（ＥＤＣＰ），或０. ０－二乙基氯磷酸酯（ＤＥＣＰ）或二乙基亚磷酯（ＤＥＰＨ）。反应５－１２小时后，溶液用弱碱水洗几次后干燥，即得到活泼酯ｄ。三、人工抗原ｅ的制备（即半抗原与蛋白质的交联）将蛋白质（或酶、糖）溶于水和二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）的溶液中，再加入与蛋白质（或酶、糖）等摩尔的三乙胺。加入由上述第二步制得的活泼酯ｄ，在０℃ ～－１０℃反应过夜，溶液在蒸馏水中于４℃下透析３天，每天换三次水，冷冻干燥，得到固体ｅ人工抗原。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉芬，阎庆金，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]